基于双链DNA互补介导的磁珠表面偶联酶固定化方法及其在生化分析中应用

Immobilization of enzyme is primary for the analytical chemistry related with enzyme catalysis, enzyme-labeled probe, enzymatic hydrolysis, and the screening of enzyme inhibitors etc. New immobilization technique is still interested even many kinds of techniques have been applied. Nucleic acid hybridization is a common tool in bioanalytical chemistry which is specific and effective by using signal-labeled complementary base pairs binding to form a double helix. A novel enzyme immobilized technique is designed based on the label of dendrimer modified magnetic nanoparticles with a sequence of single stranded nucleotide and the label of enzyme by the complementary single stranded nucleotide. The formation of MNP-nucleotides-enzyme can be manipulated by the formation of double stranded nucleotides through the temperature and salt concentration etc. With this new technique, the control of enzyme immobilization and release can be realized and applied in the enzyme capture, multi-enzyme reactions, and microscale enzymatic hydrolysis.

通过固定化酶可以高效实现酶催化反应、酶标记反应、酶解反应以及酶抑制剂筛选等工作，研究新型可控的酶固定化方法是重要的课题之一。核酸分子杂交是利用核酸互补性进行特异性、高效率识别的技术，本项目拟尝试利用核酸分子杂交体系来实现酶的动态固定化，建立基于纳米磁性颗粒表面树枝状高分子修饰的核酸片段标记/对应的互补片段标记酶的特异性且可控的杂交实现酶的固定方法，通过优化表面修饰方法、片段序列组成与长度、酶的标记方式等因素，建立可以利用温度、盐浓度等因素调控的新型动态酶固定化方法，结合磁场及磁针等工具，实现酶的定位、定时及定次序的固定化或释放，开展酶反应后酶富集分离、多重酶反应以及磁场控制微区酶反应等应用，为相关研究提供有效工具，推进酶相关分析化学方法的发展。

酶是一类具有催化特性的生物大分子，广泛分布于生命体的各个细胞与组织内，它影响着物质代谢、个体繁殖和质能转换等许多生命活动。酶大多提取自生物体内，价格比较昂贵。同时，水溶性酶难以从反应体中回收再利用，不仅在经济上造成很大的浪费，也使后续处理过程引入杂蛋白造成分离纯化的困难。本研究开展了纳米磁珠表面修饰以及DNA片段标记方法研究，探讨了DNA双链形成与解链的合适条件，开展了互补DNA片段分别标记的磁性纳米颗粒与酶的结合特点研究，建立了酶反应与CE和HPLC联用的模式，进行药物筛选和蛋白质酶切等应用；开展了多酶体系的研究，解决了多酶体系中酶的定向偶联及酶间距离调控问题，并在天然酶级联研究的基础上，引入了纳米酶作为级联酶反应单元之一，有效地解决了传统天然酶级联反应中部分稳定性不好、酶促活性不高等问题，同时开展了利用毛细管微区固定化酶微反应器实现单酶和双酶固定的研究，并将其用于蛋白质离线及在线酶切以及葡萄糖检测等应用研究；在以磁性微球为研究基体，利用DNA将酶固定在磁球表面制备固定化酶的基础上，进行了载体和固定化方法的深度延伸拓展，采用了金属有机骨架材料、DNA水凝胶、层状双金属氢氧化物等作为载体，利用DNA的简单杂交、聚阴离子性质以及DNA分子碱基和磷酸基团的特性，开展了新型酶法分析方法的开发，用于固定和封装胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶等生物酶，显著提高了酶的稳定性和重复使用性，并将制备的新型固定化酶用于饮料和血清中葡萄糖检测、水样中酚类物质及有机染料的降解、细胞内葡萄糖的实时成像以及血糖的电化学传感等方面的研究，进一步拓展了固定化酶在分析化学中的应用。