黑曲霉ATP-柠檬酸裂解酶基因生物学功能研究

ATP citrate lyase (ACL) is an cytosolic enzyme that catalyzes the cleavage of citrate to yield acetyl CoA, which links the metabolism of carbohydrates to the production of fatty acids.Here,we show that in Aspergillus niger two different subunits of ACL are encoded by two separate genes (ACL1 and ACL2),which is in contrast to animals where ACL is encoded by a single gene. The roles of ACL genes in Aspergillus niger was not fully understood. To address the roles of ACL1 and ACL2 in regulation the growth,development and metabolite in Aspergillus niger, we deleted ACL1 and ACL2, and generated acl1Δ, acl2Δ and acl1Δacl2Δ mutants. Phenotypic characterization of the mutants revealed that deletion either of the genes resulted in greatly diminished growth on complete and PDA mediums and significantly reduced spore formation. In this proposal,we will perform the following works to further characterize the roles of ACL in Aspergillus niger. First,we will identify the transcription factors for ACL1 and ACL2, and reveal their transcription mechanisms; Second, we will investigate the roles of ACL1 and ACL2 in maintaining cytosolic acetyl CoA levels; the third, we will establish the connection between ACL1 and ACL2 and citrate acid metabolite and accumulation; the forth,we will characterize the ATP-citrate lyase enzyme activity and property. This work will reveal the transcription mechanisms and physlogical roles of ACL in Aspergillus niger, which will guide the development of Aspergillus niger as a efficient cell factory.

ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）催化柠檬酸生成乙酰辅酶A，它是细胞糖代谢与脂肪酸合成之间的桥梁。申请人发现黑曲霉ATP-柠檬酸裂解酶由ACL1和ACL2两个基因编码，其功能还不清楚，本课题将对其开展研究。申请人发现构建的acl1Δ、acl2Δ和acl1Δacl2Δ基因缺失菌株生长缓慢，产孢能力也显著减弱。为了进一步揭示ACL1和ACL2基因生物学功能，本课题拟用基因敲除、基因回补、基因表达图谱、基因超表达及蛋白荧光标记等方式来研究ACL1和ACL2基因的生理作用；通过生物信息学分析，明确ACL1和ACL2基因顺式调控元件，并筛选和鉴定相关转录因子，揭示其表达调控机理；通过酶活性分析，确定其酶学特性；通过代谢流分析，建立ACL基因与柠檬酸等重要代谢产物积累的关系。本研究成果不但能揭示ATP-柠檬酸裂解酶在黑曲霉生长、发育及代谢过程中的重要作用和机理，而且也能为构建高产优质黑曲霉工程菌奠定基础。

针对黑曲霉基因同源重组频率低，难获得高效基因敲除的问题，在本课题实施过程中，我实验室成功构建了基于潮霉素B磷酸转移酶（hpg）正向筛选和博来霉素抗性基因（ble）负向筛选的正负筛选系统。应用该系统，我实验室成功对acl(2)、acs (1),cat (2)、 hatc (4)、datc (4)等13个与乙酰辅酶A合成及代谢相关的基因进行了打靶敲除，并重点对acl基因进行了表型分析及功能研究。.表型分显示acl1Δ、acl2Δ 及acl1Δacl2Δ 菌株均存在严重的缺陷：1、在PDA 和完全培养基（CM）上生长缓慢；2、产孢能力不及野生型的2%；3、丧失色素合成能力，菌丝呈现白色；4、向PDA或CM培养基中添加5-10 mM的乙酸可部分恢复基因缺失菌株的生长和产孢能力；5、向基因缺失菌株中导入相应的基因，可以恢复其正常生长。所有这些表明，acl 基因在黑曲霉中有重要的功能。.本研究对acl基因缺失菌株及超表达菌株进行了酶学分析，发现敲除acl基因的菌株完全丧失了柠檬酸裂解酶活力，而超表达菌株较野生型有更高的柠檬酸裂解酶活力。从而表明，acl基因编码黑曲霉柠檬酸裂解酶。本研究克隆了acl1和acl2基因，并分别在大肠杆菌中表达，经分离纯化，得到高纯度的ACL1和ACL2蛋白，并在体外进行ACL1与ACL2单一蛋白及混合蛋白的活性分析。研究发现，单独的ACL1或ACL2蛋白均没有柠檬酸裂解酶活力，而ACL1与ACL2混合物有较高的柠檬酸裂解酶活力。从而表明，在黑曲霉中ACL1与ACL2两个亚基共同构成柠檬酸裂解酶。.为了进一步研究ACL1和ACL2蛋白在黑曲霉的作用机理，我们构建gppd-egfp-acl1 和 glaA-cCherry-acl2 表达载体，对ACL蛋白进行荧光标记，研究其在黑曲霉生长、发育及代谢过程中的位置及动态变化。通过聚焦显微镜观察表明，Egfp-Acl1 和 cCherry-Acl2蛋白主要位于细胞质。据此推断黑曲霉 Acl蛋白主要是调控细胞质乙酰辅酶A的水平 。