从免疫调节因子PD-1探讨视网膜节细胞凋亡的发病机制

视网膜节细胞凋亡是多种眼病致盲的根本原因，但其发生凋亡的机制还不完全清楚，尚无很好的治疗方法。本项目通过对免疫调节分子PD-1在视网膜节细胞损伤中表达，活化，信号通路及生物功能等方面的研究，旨在阐明PD-1在病理性视网膜节细胞凋亡中的作用及作用机制这一重要科学问题， 并阐明抑制PD-1能否对视网膜节细胞起到神经保护作用这一关键问题。本研究将可能为这些与视网膜节细胞凋亡相关疾病的发病机制研究提供新的突破口，并为预防和治疗找到新的靶点。

背景：程序性死亡因子-1（programmed cell death-1, PD-1) 是重要的免疫调节分子。通过与其配体PD-L1或PD-L2结合，PD-1在调节免疫反应中发挥关键作用。除了在免疫反应中的共抑制作用，PD-1及其配体所产生的负性调节信号能够诱导细胞凋亡，如肿瘤组织中的细胞杀伤性T细胞，PD-1也因此成为肿瘤免疫治疗的新型靶点。近来研究证实PD-1在发育期视网膜节细胞（retina ganglion cells,RGCs)的凋亡中发挥重要作用，因此其介导的信号通路是否参与了病理情况下的RGC凋亡成了迫切需要解决的科学问题。研究目的：探讨病理情况下PD-1在RGC上的表达及其在RGC凋亡中的作用。实验方法：在小鼠中建立视神经夹伤（Optic nerve crush）模型，诱导RGC凋亡。在视网膜铺片中通过免疫荧光染色来观察PD-1在视网膜中的表达；通过Western blot和Real time PCR来检测PD-1在视网膜中蛋白和基因表达的变化。分别在正常小鼠和PD-1配体基因双敲除小鼠中建立视神经夹伤模型，伤后一周在视网膜铺片中利用RNA结合蛋白Rbpms标记RGC，检测和比较两组小鼠的RGC存活情况。伤后不同时间点在冰冻切片中检测Caspase-3 的活化情况。实验结果：免疫荧光染色结果显示视神经损伤后视网膜中PD-1的表达水平明显升高，并广泛表达在RGC的胞体，树突和轴突。实时定量PCR 证实视神经损伤后PD-1 mRNA水平显著升高。免疫荧光染色结果证实，PD-1在视网膜中主要表达在自主感光RGC的M4亚型。RGC计数分析显示，视神经损伤后7天，PD-1配体基因敲除鼠RGC数量少于正常组。免疫荧光染色和荧光定量PCR显示PD-1配体的另一特异性受体，B7-1，表达在RGC上，并且在视网膜发育后期其基因表达显著升高。科学意义：通过本研究，我们证实了PD-1不光在RGC中有稳定表达，并且在视神经损伤后明显上调。首次发现了PD-1与M4 ipRGCs的紧密联系，后者为最新发现的自主感光RGC。此外，我们证实了PD-1及其配体所介导的信号通路参与了病理情况下的RGC凋亡，为RGC凋亡的研究提供了新的思路。同时我们也首次发现了B7-1在视网膜中的表达，这一发现进一步证实了以B7家族为代表的免疫调节分子与视网膜尤其是神经节细胞的联系及其潜在意义。