DDIT4-mTOR信号轴介导的自噬在METH神经毒性损伤中的作用及其机制

The abuse of Methamphetamine (METH) has serious damage to the central nervous system. Previous studies have indicated that METH can induce neuronal autophagy, which result to neuronal apoptosis. However, the detail mechanism underlying of this is still unclear. In our preliminary study, we found that the expression of DNA-damage-inducible transcript 4 (DDIT4) was significantly increased after METH exposure in vivo and in vitro. Furthermore, the marker genes of autophagy were decreased following by DDIT4 silencing. These results suggested that DDIT4 may contribute to METH-induced autophagy. In this project, we will employ series of methods and technologies, including Molecular biology, cell biology, neurobiology methods and so on, and reach the end as below: ①Identify the key role of DDIT4 in METH-induced autophagy. ②Clarify whether DDIT4 mediated neuronal autophagy induced by METH via mTOR pathway. ③Explore whether DDIT4 blocked phosphorylated mTOR through TSC complex in METH-exposed neuron. The research will not only reveal the mechanism of DDIT4-mTOR signaling axis in the METH-induced neurotoxicity, but also is expected to offer new strategy and target for developing new drugs for protection from the METH-induced neurotoxicity.

甲基苯丙胺（METH）滥用对中枢神经系统造成严重损害。有研究显示METH能导致神经元自噬，并进一步介导神经元凋亡，但其确切机制仍不清楚。我们前期预实验发现DNA损伤诱导转录因子4（DDIT4）在METH处理后表达显著升高，下调DDIT4表达后能降低神经细胞自噬的发生。提示我们，DDIT4可能在METH诱导神经细胞自噬中起重要作用。本研究拟采用分子生物学、细胞生物学及神经生物学等研究方法和手段确定①DDIT4在METH导致的神经细胞自噬中起重要作用；②DDIT4通过mTOR信号通路调控METH致神经细胞自噬。③METH诱导DDIT4经TSC或其他途径调控mTOR。通过本研究阐明DDIT4-mTOR信号轴在METH致神经细胞自噬中的作用，并为METH新型解毒药物提供新的策略和靶点。

甲基苯丙胺（METH）滥用对中枢神经系统造成严重损害。有研究显示METH能导致神经元自噬，并进一步介导神经元凋亡，但其确切机制仍不清楚。我们前期预实验发现DNA损伤诱导转录因子4（DDIT4）在METH处理后表达显著升高，下调DDIT4表达后能降低神经细胞自噬的发生。提示我们，DDIT4可能在METH诱导神经细胞自噬中起重要作用。本课题利用METH中毒细胞（PC12和 SH-SY5Y细胞）和SD大鼠模型（亚急性和慢性），发现在细胞和动物（前额叶皮质、海马和纹状体区域）水平上，METH处理后DDIT4和自噬相关基因Beclin 1、LC3-Ⅱ的表达量均显著升高。在体外实验，采用RNA干扰技术沉默DDIT4的表达，结果显示沉默DDIT4的表达后，自噬相关基因Beclin 1、LC3-Ⅱ的表达量显著降低，自噬小体形成减少，凋亡相关基因caspase3、PARP的表达量减少，细胞凋亡率下降，p-mTOR/ mTOR蛋白表达比上升；引入自噬抑制剂3甲基腺嘌呤 (3-MA)和激动剂雷帕霉素（Rap）进行干预，发现 3-MA能够提高p-mTOR/ mTOR蛋白表达比，减少自噬相关基因Beclin 1、LC3-Ⅱ的表达量，而Rap却能逆转这一现象。在体内实验，利用立体定位注射技术沉默METH亚急性中毒大鼠纹状体区域DDIT4的表达，发现自噬相关基因Beclin 1、LC3-Ⅱ和凋亡相关基因caspase3、PARP的表达量均减少。上述结果提示DDIT4通过调控mTOR-自噬信号通路，在METH诱导的神经毒性中发挥重要作用。本课题也利用METH中毒细胞SH-SY5Y细胞和亚急性SD大鼠模型，发现C/EBPβ通过DDIT4/TSC2/mTOR信号通路调节METH诱导的细胞自噬，通过Trib3/Parkin/α-syn信号通路调节METH诱导的经典线粒体凋亡信号通路，从而在METH诱导的神经毒性中发挥重要作用。在物证研究方面，我们基于16S rDNA高通量测序技术发现唾液及阴道分泌物的特异微生物。通过本研究阐明了DDIT4-mTOR信号轴在METH致神经细胞自噬中的作用，阐明了C/EBPβ在METH诱导的自噬和凋亡中的分子机制，为METH新型解毒药物提供了新的策略和靶点。