HBV基因型和准种优势株对筛选广西肝癌高发区高危人群的作用及其致癌机制的研究

In the high-risk group of HCC consist of 3500 HBsAg-positive members in high-incidence area in Guangxi, Nested case-control study will be used, with the members finally suffering from HCC in the cohort as case and the matching members as control, to detect HBV genotype and quasispecies in serum by Type-specific-primers PCR and sequencing method, and compare the different distribution between case and control. At the same time, the changes of nucleotide sequences of HBV in cases will be monitor before and after onset. HBV-Alu-PCR will be used to identify the HBV integration sites in host chromosomes of cases, the highly preferred HBV integration sites and target cellular genes will be found in different genotypes and quasispecies. Finally, cell models including integrated HBV genetic fragments will be constructed in vitro, to explore the role and mechanism of HBV integration genes and protein expression in the hepatocarcinogenesis. Ultimately, clarify problems like what HBV genotype and dominant cloning, how integrate to the chromosome, and what mechanisms in the development of HBV-induced HCC. Expected to find out the HBV genotype closely associated to HCC in HBsAg-positive members, and the dominant cloning in quasispecies to the evolution of "hepatitis to HCC", provide new ideas to select high-risk groups for HCC screening.

在广西肝癌高发区3500名HBsAg阳性的高危人群队列中，采用巢式病例对照的研究方法，以该队列中最终发生肝癌的成员为病例，符合匹配条件的成员为对照，通过型特异性引物PCR法和测序法检测血清中HBV的基因型和准种，比较其在两组成员中分布的差异。同时，监测病例发病前后多个时间点HBV准种核苷酸序列的变化。采用HBV-Alu重复序列-多聚酶链反应法，分离鉴定HBV在病例宿主染色体中的整合位点，寻找不同HBV基因型和准种的优势整合位点和靶基因。最后，在体外构建含HBV整合基因片段的细胞模型，探索HBV整合基因和蛋白表达在肝细胞癌变中的作用及机制。最终阐明是何种HBV基因型及克隆优势株、如何与机体基因组整合、通过什么机制导致肝癌的发生发展等问题。预期可在HBsAg阳性者中找出与肝癌密切相关的HBV基因型，及"肝炎-肝癌"演变过程中HBV准种的致癌优势株，为肝癌筛查工作中高危人群的确定提供新的思路。

对肝癌高危对象即乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性者开展早期肝癌的筛查是降低死亡率、提高生存率的有效措施，但广西当地人群HBsAg的高携带率使肝癌筛查工作难以推广普及。本项目试图在早期肝癌患者中寻找相关的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）基因型及克隆优势株，并探讨其如何与机体基因组整合、通过什么机制导致肝癌的发生发展等问题，为优化肝癌的筛查方案提供理论依据。结果显示：（1）广西肝癌高发区HBV感染以C基因型为主，占78.2%，C1亚型患肝癌的风险更高（χ2=8.401，P=0.038）；低发区B、C基因型分别占60.13%和39.87%，以B型为优势基因型。（2）在HBV的基因编码区中， Pre-S区缺失（OR=7.021，95%CI 2.692-18.314）、Pre-S2起始密码子变异（OR=5.633，95%CI 1.869-16.983）、T53C变异（OR=5.313，95%CI 1.518-18.600）与肝癌相关。S区T140C突变（OR=0.138）及T300C突变（OR=7.877）与肝癌关系密切。BCP区A1762T/G1764A突变（OR=5.459，95% CI为1.397～21.332，P=0.015）和T1858C突变（OR=3.881，95% CI为1.462-10.305，P=0.006）是肝癌发生的危险因素。动态监测HBV基因突变点发现肝癌患者A1762T/ G1764A、T1858C、PreS区缺失，PreS2起始密码子突变，C3026T、G1896A于肝癌发生前4-5年出现并趋于稳定，T53C在诊断前2-3年出现。（3）用二代测序的方法发现肝癌组HBV准种群中与对照组存在差异的SNP位点有44个，其中非同义SNP有15个，位于HBV X区的最多，且大部分在发病前2年出现。（4）肝癌病例的准种复杂性与多样性均高于对照组，并存在优势克隆株。（5）HBV X基因的常见整合位点位于1号染色体（1p36.32），整合部位的常见靶基因有5个（MLL4、GNAT1、TERT、HRAS和P73）。本研究有助于在HBsAg慢性携带者中筛选出针对性更强的HBV相关肝癌的高危人群并使其受益于肝癌筛查工作，为肝癌的病因学和发病机理研究提供实验和理论依据。