广西肝癌高发区肝癌血清预警蛋白质的筛选研究

在广西肝癌高发现场已经建立4000名HBsAg阳性肝癌高危人群队列的生物信息库和标本库基础上，本研究拟采用巢式病例对照研究方法对队列成员定期、定员复查随访，以观察期间发生的肝癌患者作为病例组，并按照配对条件从未发生肝癌的队列成员选择匹配对照组。应用蛋白质芯片-飞行时间质谱技术，对病例组发病前后采集的多次血清和对照组血清进行差异表达蛋白质组筛选，动态分析肝癌高危人群队列中的肝癌患者发病前后的血清蛋白质组变化，并比较病例组和对照组的血清蛋白质组表达差异，从而鉴定出具有早期诊断价值的肝癌标记蛋白；同时，综合流调资料和其他血清学检测结果，为阐释肝癌发病的分子机制提供实验和理论依据。

对HBsAg阳性肝癌高危人群队列定期复查随访。将其中陆续新发的肝癌、肝硬化、肝炎患者分别组成肝癌组、肝硬化组、肝炎组，并匹配正常对照组；应用iTRAQ结合LC-MS/MS技术动态研究从HBV感染向肝癌发展过程中蛋白质组的变化规律，采用凝集素芯片技术分析血清糖蛋白凝集素亲和谱变化，用免疫印迹等方法验证。应用SELDI-TOF-MS技术对肝癌组和对照组的miRNA-146a基因rs2910164位点、miRNA-196a2基因rs11614913位点、MDR1基因C1236T rs 1128503进行SNP分型；以Sequenom MassARRAY SNP技术检测肝癌高发家系和对照家系TNF-α-308、TNF-α-238的基因型。采用RIA法测定肝癌、肝硬化、肝血管瘤、正常对照等4组血清β2-MG含量，并对肝癌组术前和术后血清β2-MG含量动态检测。研究结果显示：(1)共鉴定到280个蛋白，其中差异蛋白93个。肝炎组与正常组比较有 43个差异蛋白；肝硬化组与正常组有70个差异蛋白；肝癌组与正常组有51个差异蛋白。（2）K-means聚类分析表明，鉴定获得所有蛋白的趋势共分为36种类型。随着肝癌发生呈上升趋势的主要是细胞代谢过程蛋白（聚类4和34）；补体蛋白表达（聚类2、9和19）在肝炎阶段呈上升趋势，在肝硬化和肝癌阶段呈下降趋势。（3）对93个差异蛋白进行GO分类，发现其主要位于细胞外基质（53%）；主要参与生物调控（33%）、代谢（25%）和免疫反应（14%）等生物学过程；分子功能方面主要涉及蛋白结合（37%）和酶活性（35%）。（4）本研究与文献报道通过相同方法筛选的差异蛋白比较，发现AFP、APOE、PON1、C3等为共有差异蛋白，且表达趋势一致。（5）选取差异蛋白GELS、QSOX1和CD14进行Western blot验证， GELS和QSOX1在正常组、肝炎组、肝硬化组、肝癌组等各组中表达依次增加，而CD14表达依次减少，与iTRAQ分析结果一致。（6）CD14单独诊断肝癌时AUC为0.760，P<0.05；Cut-off值为3.16ng/ml时，灵敏度为94.7%，特异度为50%。差异蛋白CD14与AFP联用时，AUC为0.889，P<0.05；ROC曲线下面积明显提高，灵敏度为84.2%，特异度为83.3%。（7）肝癌发生过程中，血清糖蛋白表现出对1