广西肝癌高发区肝癌高危人群的预警标志物筛选研究

在广西肝癌高发现场已经建立的2.5万肝癌高危人群队列以及10对肝癌高发家系和对照家系的生物信息库和标本库基础上，以高危人群队列中发生的肝癌病例为病例组、从队列中选择未发生肝癌的队列成员进行匹配对照，同时，选择肝癌高发家系成员和对照家系成员为研究对象。应用cDNA微阵列芯片技术对肝癌家系与对照家系进行对比研究、对队列中肝癌患者发病前与发病后进行对比研究、对队列中肝癌患者与同期队列中匹配的正常人群进行对比研究，系统比较肝癌家系与对照家系、肝癌患者发病前后、肝癌患者与匹配对照的外周血单个核细胞差异基因表达，从中挑选差异表达基因用实时荧光定量RT-PCR验证，运用生物信息学的方法加以分析，寻找与肝癌发生发展密切相关的特异性的预警分子标志物，建立能够判断肝癌高危人群发生肝癌危险性的预测体系，并提供对早期诊断肝癌有价值的生物信息，为肝癌的病因、发病机理、预防、诊断和治疗研究提供理论依据。

肝癌的发生与许多已知的和未知的基因相关，有报道：用基因芯片的方法筛选肝癌差异表达基因，但大多数研究是用肝癌组织及癌周组织检测，用肝癌患者外周血筛选特异性强和灵敏度高的肝癌预警分子标志物，无论在肝癌分子流行病学研究、肝癌现场筛查和肝癌的早期诊断等方面都具有重要的价值。课题依托广西肝癌高发现场，建立了2万多肝癌高危人群队列以及10多个肝癌高发家系和对照家系的生物信息标本库，以队列中发生的肝癌、正常人群、肝癌家系和非癌家系为研究对象，应用cDNA微阵列芯片、SNP基因型分型以及RFLP方法等技术检测肝癌相关生物标志物，从而筛选肝癌高危人群预警标志物和易感基因。进行了以下几方面的研究和取得的重要结果：（1）从该队列中选择肝癌病例9例，按照1:1配比对照组。提取血细胞总RNA并纯化mRNA，逆转录合成荧光标记的cDNA探针，与罗氏人表达谱芯片进行杂交，筛选出两组外周血的差异表达基因。通过Gene Ontology、KEGG和NCBI等数据库分析，挑选候选基因。结果从4万多个基因中筛选出肝癌患者和对照的差异基因有42条，占基因总数的0.93‰，其中显著上调的基因有20条，显著下调的基因有22条，并对其中的DUSP1和PROK2基因进行了初步验证，表明了PROK2和DUSP1基因与广西肝癌高发区肝癌的发生有密切关系。（2）选择该队列12个肝癌高发系（124例）和12个对照系（129例），采用Sequenom MassARRAY SNP基因型分析技术检测了21个SNP位点，筛选出XPD，TNF-α，C0X2和MDR1基因等四个基因位点在肝癌家系和对照家系中的差异有统计学意义，这些基因多态性可能与广西肝癌家族聚集性有关。（3）选取该队列113例肝癌及113名正常人群进行病例对照研究，以PCR-RFLP法检测其外周血XRCC1Arg399Gln和IGF-2、IGF-2R、IGF-1R的基因多态性。结果阐明了XRCC1Arg399Gln以及IGF-2R基因多态性与广西肝癌高发区肝癌发生有密切关系。（4）采用蛋白质芯片杂交技术，在肝癌病例组和匹配对照组血清中筛选差异蛋白质，结果肝癌病例出现IGFBP-2明显上调和P21蛋白明显下调，提示IGFBP-2和P21蛋白的变化与肝癌的发生、发展可能有关系。因此，检测IGFBP-2和P21蛋白可能成为筛选肝癌高危人群血清指标和肝癌的辅助诊断指标。