细胞重编程诱导耳蜗毛细胞再生的研究

Loss of cochlear hair cells is the major course of sensorineural hearing loss. Because spontaneous hair cell regeneration doesn't occur in auditory sensory epithelia of human and mammal, permanent hearing loss will occur once they are injured. Ideal biomedical treatment for sensorineural hearing loss is to reconstruct the injured cochlear structure and function by regenerating hair cell. This project has enclosed the scientific issue of cell reprogramming approach for treatment of sensorineural hearing loss. We try to explore hair cell regeneration through cell reprogramming technique by co-transfecting key genes involved in regulation of hair cell generation and development. In vitro and in vivo animal models of severe hair cell damage are employed. With Lentivirus vector, LV-pax2, LV-sox2, LV-islet1, LV-brn3.1 and LV-math-1 will be co-transfected to the injured cochlear sensory epithelium. After transfection, the proliferation and differentiation of sensory epithelium cells and regeneration of hair cells will be investigated. Meanwhile, function of regenerated hair cell and its correlative hearing restore will be examined by ABR and DPOAE. Our research objects includes: 1) to establish a safe and high-efficiency cochlear lentivirus transfection technique; 2) to explore theory and technology of hair cell regeneration through cell reprogramming approach; 3) to establish the experimental foundation for treatment of sensorineural hearing loss by cell reprogramming approach.

耳蜗毛细胞损伤缺失是感音神经性聋发生的主要原因，由于人类及哺乳动物耳蜗毛细胞不存在自发再生能力，一旦发生损伤将产生永久性耳聋。理想的治疗感音神经性聋的方法是通过毛细胞再生达到耳蜗结构和功能修复。本项目围绕细胞重编程技术及感音神经性聋基因治疗的科学问题，应用毛细胞发生和发育重要调控基因组合共转染技术，探索细胞重编程策略再生毛细胞的途径。拟采用离体和活体耳蜗毛细胞重度损伤模型，以慢病毒为载体在损伤耳蜗感觉上皮共转染LV-pax2, LV-sox2, LV-islet1, LV-brn3.1, LV-math-1基因，研究上述基因共转染后损伤感觉上皮细胞增殖、分化及毛细胞再生状况；同时研究新生毛细胞的功能及毛细胞再生所致的听觉功能修复。实现下列研究目标：1）建立高效安全的慢病毒耳蜗转染技术；2）探索细胞重编程策略再生毛细胞的理论和技术；3）为细胞重编程策略治疗感音神经性聋奠定实验基础。

耳蜗毛细胞损伤缺失是感音神经性聋发生的主要原因，由于人类及哺乳动物耳蜗毛细胞不存在自发再生能力，一旦发生损伤将产生永久性耳聋。理想的治疗感音神经性聋的方法是通过毛细胞再生达到耳蜗结构和功能修复。本项目围绕细胞重编程技术及感音神经性聋基因治疗的科学问题，应用毛细胞发生和发育重要调控基因组合共转染技术，探索细胞重编程策略再生毛细胞的途径。通过本项目的实施，我们取得了以下几项重要成果：1、我们建立了高效稳定的多基因转染技术，建立了良好的成年鼠耳蜗培养体系及病毒转染模型，使体外成年鼠毛细胞再生药物的筛查及基因干预成为可能。2、Notch信号通路是内耳前体细胞增殖的负性调控因素。我们发现，抑制Notch信号通路能够使处于增殖静止状态的Lgr5+内耳前体细胞重新进入细胞周期，增殖并转分化为毛细胞；抑制Notch信号通路能够促进Wnt信号通路的核心转录因子β-catenin和下游基因的上调，进而促进前体细胞增殖，提示Notch和Wnt信号通路在内耳中存在相互作用，是维持内耳细胞数目和特异性结构的关键因素；此外我们还发现，抑制Notch信号通路介导的支持细胞向毛细胞的直接转分化过程并不依赖于Wnt信号通路的活化。因此调控Notch信号通路，可能促进内耳感觉前体细胞重新进入细胞周期，并向毛细胞分化，从而实现内耳毛细胞的增殖再生。相关研究成果发表在2015年的PNAS上。3、我们通过同时实现 Notch信号抑制、Wnt信号活化和Atoh1高表达的多基因共调控细胞重编程技术，在耳蜗感觉上皮中得到了大量的增殖细胞，并且成功的让这些增殖细胞转分化为毛细胞。同时探索了Wnt和Notch信号通路共同作用调控内耳毛细胞再生的分子机制，并对Wnt和Notch信号通路在耳蜗感觉上皮中的相互作用机制进行了详细的阐释。我们通过细胞重编程技术能够有效的促进小鼠耳蜗毛细胞增殖再生，这为实现毛细胞的功能性再生、恢复受损听力，提供了新的思路和可能。该成果于2016年8月发表在神经科学学会官方杂志The Journal of Neuroscience上。本项目已发表包括PNAS、J NeuroSci杂志在内的SCI论文48篇。