CD4+ T细胞在ES源性视网膜色素上皮细胞移植视网膜下腔后免疫反应中的作用及调控

With the development of stem cells and regenerative medicine, clinical trials on the treatment of human age-related macular degeneration and Stargardt’s disease through subretinal transplantation of embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium cells (ESC-RPE) bring hope to blind patients with the incurable retinal degenerative diseases. In order to avoid potential immune injection, all patients in these studies have used systemic immunosuppressive agents with toxic side effects. A most recent study in 2016 suggests that CD4+ T cells may play an important role in immune response after the subretinal transplantation of photoreceptor cells. However, whether immune response occurs after subretinal transplantation of ESC-RPE or not, its regulation mechanism and optimization of immunosuppressive regimens are current issues needed to be solved urgently. Do CD4+ T cells play a crucial role in the immune response after subretinal transplantation of ESC-RPE? Through laser capture microdissection combined with single cell RNA sequencing and other techniques, this study will investigate the effects of CD4+ T cells including Th1/Th2, Treg and Th17 cells on immune response and its regulation mechanism after mouse subretinal transplantatiton of ESC-RPE, further optimize the immunosuppressive regime, and provide reference for clinical application of subretinal transplantation of ESC-RPE.

随着干细胞再生医学的发展，ES源性视网膜色素上皮细胞（ESC-RPE）视网膜下腔移植治疗人类年龄相关性黄斑变性和Stargardt’s病的临床研究给视网膜变性疾病所致的不可治愈盲患者带来一线希望。为避免可能存在的移植排斥，这些研究中的患者都全身使用了有毒副作用的免疫抑制剂。2016年最新研究提示CD4+T细胞可能在光感受器细胞视网膜下腔移植后的免疫反应中起重要作用。然而，ESC-RPE视网膜下腔移植后免疫反应发生与否、调控机制和免疫抑制方案的优化都是目前亟待解决的问题。CD4+T细胞是否在ESC-RPE视网膜下腔移植后免疫反应中起关键作用？本研究将通过激光显微切割结合单细胞RNA测序等技术，深入探讨CD4+T中Th1/Th2、Treg和Th17细胞在小鼠ESC-RPE视网膜下腔移植后的免疫反应作用和调控机制；进一步优化免疫抑制药物治疗方案；为ESC-RPE视网膜下腔移植的临床应用提供借鉴。

随着干细胞再生医学的发展，ES源性视网膜色素上皮细胞（ESC-RPE）视网膜下腔移植治疗人类年龄相关性黄斑变性和Stargardt’s病的临床研究给视网膜变性疾病所致的不可治愈盲患者带来一线希望。为避免可能存在的移植排斥，这些研究中的患者都全身使用了有毒副作用的免疫抑制剂。2016年最新研究提示CD4+T细胞可能在光感受器细胞视网膜下腔移植后的免疫反应中起重要作用。然而，ESC-RPE视网膜下腔移植后免疫反应发生与否、调控机制和免疫抑制方案的优化都是目前亟待解决的问题。本研究拟探究CD4+T细胞在ESC-RPE视网膜下腔移植后免疫反应中的关键作用和调控机制；进一步优化免疫抑制药物治疗方案；为ESC-RPE视网膜下腔移植的临床应用提供借鉴。.因此，本研究采用拟胚体悬浮培养方案体外诱导小鼠胚胎干细胞长出视泡结构，贴壁培养诱导RPE，但由于效率较低且不稳定导致后续移植工作无法进行，本研究尝试优化分化方案。首先，使用了添加α-MSH的三维转二维的优化诱导分化培养体系，提高了mESC源性的RPE细胞分化和成熟。此外，项目尝试在干细胞向视网膜细胞分化的3D培养体系中添加不同发育时间的视网膜条件培养液，提高了干细胞早期的存活率及其向视网膜方向（尤其是感光细胞方向）分化的效率；对视网膜调节培养液成分进行蛋白组学分析，筛选出可能影响ESC向视网膜分化的七个候选蛋白：Sod-1、Ckb、Dbi、Clcf1、Rbm3、Crmp1以及Dpysl2。再次，结合脂肪间充质干细胞的免疫调节能力，项目将CD4+T与脂肪间充质干细胞条件培养液（AMSC-CM）培养的小鼠原代RPE细胞（mRPE）进行共培养，明确其免疫原性；后续实验也将补充探究mRPE联合AMSC-CM移植视网膜下腔后的免疫排斥情况。. 由于3D培养体系诱导分化mES-RPE效率较低且不稳定，不足以满足后续视网膜下移植的要求；加之受新冠疫情影响，C3H/HeN小鼠的引进时间远长于预期，导致项目整体进度略落后于原计划且实验计划有所改变。后续实验也将补充探究mESC源性的RPE的稳定诱导方案及其视网膜下腔移植后免疫反应。