microRNA调控胚胎干细胞源性的视网膜神经上皮层血管化的研究

Medical workers have been dreaming of regenerating an artificial retina to bring a glimmer of hope to the incurable blind patients with retinal diseases. However, the source of ideal retinal graft remains an insurmountable problem. Until 2011, the embryonic stem cell (ESC)-derived neural retina without vascular in vitro three-dimensional culture system laid a solid foundation for the regeneration of artificial retina. Vascularization is the most important factor to make ESC-derived neural retina function. microRNAs (miRNAs), upstream regulators of genes involved in eye development such as Pax6/CRX/Notch pathway, have more important and stronger effects on the retinal vascularization. Therefore, we aim to screen out one or more miRNAs which play critical roles in retinal vascularization based on the characteristics of mice retinal vascular development and miRNA array; and further investigate the effects and underlying mechanism of the temporal and sequential expression of miRNA on regulating the vascularization of ESC-derived neural retina by Adeno-X Tet-on and in vitro three-dimensional culture system. This study will lay a foundation for regenerating the artificial retina, and also provide new insights for vascular developmental biology.

医学工作者梦想着人工再造视网膜能为世界范围内各种视网膜疾病所致的不可治愈盲患者带来一线希望，但理想视网膜移植物来源仍是难以逾越的困难。2011年体外三维培养的胚胎干细胞（ESC）源性无血管的视网膜神经上皮层为人工再造视网膜奠定了坚实的基础。然而，要培育出ESC源性的功能化视网膜必须先诱导其血管化。microRNA(miRNAs)是比眼发育相关基因如Pax6/CRX/Notch等通路更上游的、作用更广泛的调控因子。miRNA是否能调控ESC源性视网膜神经上皮层血管化？因此，本研究将根据小鼠视网膜血管发育的时序特点和利用miRNA芯片技术筛选出调控小鼠视网膜血管发育过程中起关键作用的一个或多个miRNA；并利用Tet-on腺病毒和体外三维共培养系统，深入探讨时序性表达miRNA调控ESC源性的视网膜神经上皮层血管化的作用及其机制，为再造功能化视网膜奠定基础；同时也为血管发育生物学提供新理论。

医学工作者梦想着人工再造视网膜能为各种视网膜疾病所致的不可治愈盲患者带来一线希望，但理想视网膜移植物来源仍是难以逾越的困难。目前科学家已经成功在体外三维培养得到的胚胎干细胞（ESC）源性无血管的视网膜神经上皮层。然而，要实现ESC源性的视网膜神经上皮层的功能化必须先诱导其血管化。因此寻找视网膜血管发育的关键调控因素成为了本研究的重点。文献报道microRNA(miRNAs)是比眼发育相关基因如Pax6/CRX/Notch等通路更上游的、作用更广泛的调控因子。. 因此，本研究根据小鼠视网膜血管发育的时序特点，取P0-P14天的小鼠视网膜组织，提取视网膜组织总RNA，利用miRNA芯片技术筛选出了调控小鼠视网膜血管发育过程中起关键作用的miRNAs： mmu-miR-93-5p、mmu-miR-20a-5p和mmu-miR-92a-3p、miR-124a-3p，并制备了高表达以及沉默miR-92a-3p、miR-124a-3p和mmu-miR-93-5p和mmu-miR-20a-5p的AAV。在P1天正常新生小鼠以及P7天病理性视网膜新生血管模型OIR小鼠玻璃体腔内分别注射高表达或沉默miR-92a-3p和miR-124-3p的AAV，研究它们对小鼠视网膜血管发育的影响。而且本研究在3D诱导体系中成功诱导得到小鼠mESC源性optic-cup，发现在培养体系中加入小分子化合物CHIR99021，可诱导得到大量的mESC-RPE。此外，本研究优化了Xeno-free条件下诱导人ESC向RPE分化的培养体系，通过在培养液中添加DKK-1，Noggin，IGF-1，bFGF，以及CHIR99021可快速诱导人ESC分化为RPE细胞。. 由于3D培养体系培养胚胎干细胞源性视网膜神经上皮层的成功率较低，项目整体进度略落后于原计划，后续研究将再前面研究基础和成果上进一步深入探讨时序性表达miRNA调控ESC源性的视网膜神经上皮层血管化的作用及其机制，为再造功能化视网膜奠定基础和提供新思路；同时也为血管发育生物学提供新理论。