视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞后排斥反应的机制和调控研究

Abstract: RPE cell replacement therapy is becoming a research hotspot in the treatment of retinal diseases. Multiple clinical trials have been performed recently in the world, which have achieved remarkable progress. So far our group has accomplished 6 cases of fetal RPE cells transplantation in patients with dry AMD, and all the cases are in the follow up period. Previous experiments in primate animals showed that the immune rejection occurred after RPE cells transplantation. On the basis of this result，we speculated that although the subretinal space is regarded as an immune privileged site，chronic rejection occurred after cell transplantation. According to the fact that Mesenchymal stem cells（MSC）have targeted immunoregulatory function，we propose a hypothesis that co-transplantation of fetal RPE cells and MSCs into the subretinal space can inhibit immune rejection, promote cell survival and improve the expression of RPE markers. Our preliminary experimental results confirmed that the co-culture of a small amount of MSCs and RPE cells can promote the maturity of fetal RPE cells. Our study aims to clarify the mechanism of immune rejection after transplantation in primate animals, especially the key role of inflammatory micro environment. Meanwhile to determine the feasibility of improving therapeutic efficacy through co-transplantation of RPE cells and MSCs in primates and explore its mechanism，which will lay a solid foundation for speeding up the clinical translational and regenerative medicine of RPE cells.

RPE细胞替代治疗是当前世界范围内眼科的研究热点。本团队已完成了五例人类流产胎儿RPE（hfRPE）移植治疗干性AMD的临床试验，我们在临床前的动物试验中发现了灵长类动物RPE移植后出现免疫排斥现象，提出尽管视网膜下腔存在免疫豁免，RPE移植后仍可存在慢性、低水平免疫排斥。已有研究表明间充质干细胞（MSC）具有炎症和免疫的调节功能，我们的预实验又证实少量MSC与RPE混合培养可以抑制RPE的炎症信号通路。本申请拟通过炎症基因敲除的啮齿类和灵长类动物的hfRPE移植实验，研究移植细胞的免疫原性和视网膜下腔炎性微环境在慢性排斥中的机制；通过hfRPE细胞与MSC联合移植，改善视网膜下腔的微环境，抑制免疫排斥，促进细胞长期存活，提升治疗效果。通过本研究有望全新揭示hfRPE移植后视网膜微环境状态，及其在免疫排斥中的作用，为RPE移植的临床转化奠定基础。

近年来RPE 替代治疗成为了视网膜退行性病变治疗中最令人瞩目的研究热点。然而，RPE 替代细胞是否能维持在原位发挥长期、稳定的治疗效应，视网膜下腔移植微环境中免疫排斥反应在RPE替代治疗中的调控作用及作用机制还不明确，亟待深入研究。 我们课题组在RPE 替代治疗的细胞准备及视网膜移植微环境中的免疫调控作用方面主要开展了如下研究： .1、.RPE 替代治疗的细胞准备。完成了视网膜类器官的培养，胎儿RPE细胞的GMP环境下培养。创造了一个全新的培养体系，运用单细胞测序技术和视网膜类器官培养技术，报告转录组分析3D神经视网膜分离的457个单个细胞在之前和之后的六个时间点采集的视网膜类器官视网膜神经发生。另外，在RPE培养过程中发现，Gremlin-1可以通过激活TGF-β通路和抑制BMP通路，导致RPE细胞发生上皮向间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。.2、.小分子维生素C和丙戊酸对供体RPE转归的调控作用。利用小分子维生素C和丙戊酸处理RPE后，可以提高RPE的增殖能力，逆转EMT，并得到具有多向分化潜能的视网膜色素上皮干细胞（retinal pigmented epithelial stem-like cells, RPESCs）。这些RPESCs在体外不仅可以分化得到RPE细胞，还可以向成脂成骨成软骨分化，并分化为一种光感受器细胞——视杆细胞，在移植治疗碘酸钠处理的视网膜退行性疾病模型小鼠中具有更强的光感受器细胞解救效果和视觉功能恢复。.3、.RPEs与间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）共移植的可行性。我们的研究发现MSCs可以通过抑制NF-κB/NLRP3通路，保护受到氧化损伤的RPEs，并且RPEs与MSCs共移植治疗视网膜退行性疾病模型小鼠后，小鼠的光感受器细胞解救效果和视觉生理恢复显著高于单纯的RPEs或单纯的MSCs移植的小鼠。.4、.近红外共轭高敏探针（PFO-DBT）对RPE进行标记后移植细胞的活体示踪。将探针与fRPE共孵育以标记细胞，将标记细胞进行小鼠视网膜下腔移植，使用小动物可见光成像技术，实现了对RPE的活体示踪，为量化细胞存活信息提供了可能。