NF-kB信号通路在磨损颗粒诱导炎症性骨溶解中的作用研究

Arthroplasty is the most effective means of treatment of severe joint disease, aseptic loosening is an important complication of arthroplasty, aseptic loosening a serious impediment to the promotion and application of artificial joints. How effective non-surgical ways to prevent and treat aseptic loosening has become the hot spot of research in the field of joint surgery. The biological basis of aseptic loosening is osteolysis caused by wear particlesinduced inflammation and osteoclast cell activation. Preliminary studies show that the nuclear transcription factor{kappa} B (NF-kB) signaling pathway play an important role in inflammation and activation of osteoclasts. In this study, the use of aseptic osteolysis in animal models to explore the role of NF-kB signaling pathway in wearparticle-induced inflammatory osteolysis, and interference technology to inhibition of NF-kB p65 subunit, in order to observe its effect on inflammation and osteolysis mitigation. The field of biological therapy for the aseptic loosening of artificial joint replacement surgery in this study provide a theoretical basis and new ideas.

无菌性松动是人工关节关节置换术的重要并发症,这种无菌性松动严重阻碍了人工关节的推广应用，如何有效地通过非手术方式来预防和治疗人工关节无菌性松动已成为关节外科领域的研究热点。无菌性松动发生的生物学基础是磨损颗粒诱发的一系列炎症反应及破骨细胞的活化导致的骨溶解。前期研究表明，核转录因子kappaB （NF-kB）信号通路在炎症发生及破骨细胞的活化中都起到了重要作用。本研究将利用无菌性骨溶解的动物模型，探讨NF-kB信号通路在磨损颗粒诱导的炎症性骨溶解中的作用，并利用干扰技术对NF-kB p65亚基进行抑制，从而观察其对炎症反应及骨溶解的缓解作用。本研究将为人工关节置换术后无菌性松动的生物学治疗领域提供理论基础和新的思路。

按计划完成本项目研究任务。.目的：人工关节无菌性松动是人工关节置换术的主要并发症，而磨损颗粒介导的的炎症反应是引发无菌松动的主要原因。本研究通过构建小鼠的气囊植骨模型，模拟了炎症的发生，并研究了NF-KB信号通路在炎症发生中的作用，通过RNA干扰技术，抑制了NF-KBP65的表达，并观察其对炎症发生的影响。.方法：（1）设计4条靶向小鼠NF-KBP65基因的siRNA序列，构建RNAi慢病毒载体，进行重组慢病毒的包装生产。（2）将构建好的慢病毒转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，通过Realtime PCR检测NF-KBP65基因的表达，筛选出最高效的干扰序列。（3）RNAi有效靶点慢病毒大量包装，观察体外环境下慢病毒对NF-KBP65基因表达抑制效率。（4）构建小鼠的植骨气囊模型，按照对照组（CON group），错配siRNA干预组（MS group），NF-KBP65 siRNA干预组（P65 group），通过局部气囊注射慢病毒液进行生物学干预，10天后处死小鼠取材，进行组织学和分子生物学分析。颅骨-气囊组织的HE染色观察炎性反应的程度和骨破坏的情况；从mRNA水平和蛋白水平检测颅骨-囊壁组织中P65基因的表达变化；检测P50、TNF-α和IL-1β的mRNA水平。..结果：（1）成功构建了靶向小鼠VEGF基因的siRNA表达载体，筛选出5’- CGAATCCAGACCAACAATA -3’为最高效序列。（2）成功构建了携带最高效siRNA序列的重组慢病毒。（3）靶向小鼠NF-KBP65基因的重组慢病毒在体外条件下有效抑制了P65基因的表达，干扰效率达到50.4%。（4）成功构建了小鼠植骨气囊模型，HE染色显示P65组较对照组气囊囊壁厚度显著降低（P<0.05）, 炎症细胞数目显著减少（P<0.05），骨破坏程度减轻。P65组中颅骨-气囊组织P65基因的mRNA水平和蛋白水平表达较对照组显著降低（P<0.05），P50、TNF-α和IL-1β的mRNA水平表达也显著降低（P<0.05）。.结论：（1）应用RNA干扰技术在体外和体内条件下可以有效的抑制NF-KBP65基因的表达。（2）在小鼠植骨气囊模型内局部应用慢病毒介导靶向NF-KBP65siRNA能有效缓解磨损颗粒诱发的炎症性骨溶解反应。