Malat1—miRNA网络途径调控诱导型多能干细胞向内皮细胞分化过程及其表观遗传学机制

The discovery of reprogramming induced pluripotent stem (iPS) cells from somatic cells could pave the way for major advances in regenerative medicine. LncRNA are involved in a variety of basic biological processes, such as cardiogenesis, hematopoietic lineage differentiation, and oncogenesis. Better understanding of the complex molecular signals that are evoked during iPS cell differentiation towards endothelial cells (ECs)may allow specific targeting of their activities to enhance cell differentiation and promote tissue regeneration. In this study we explore for the first time that the functional role of malat1 involved in EC differentiation derived from iPS cells. Moreover, we detected the mechanism of malat1 during the differentiation from iPS towards ECs. Finally, the effect of malat1 to induce angiogenesis has been evaluated in vitro and in vivo by Matrigel plugs assays. This may allow us to propose a novel role for malat1 as a potential regulator of the phenotypic switch during vascular cell differentiation. This study provides support to the notion that with diligent efforts to understand the molecular mechanisms of vascular cell fate, stem cell regenerative therapy may ultimately become a reality and shift the paradigm to treat cardiovascular disease.

长链非编码RNA是近年来研究最热门的非编码RNA之一,具有多种复杂的生物调控功能，但在干细胞领域特别中的研究几乎为零。本课题在前期研究基础上，建立慢病毒载体稳定表达malat1前体或反义RNA的小鼠iPS细胞株。从正负两个方面探讨malat1在iPS细胞向ECs定向分化过程中的生物学功能；机制方面观察malat1对miRNA影响是否通过pre-miR的吸附作用调控分化，并采用甲基化测序检测对内皮细胞标志基因启动子甲基化状态,以染色质免疫共沉淀方法检测对启动子区域的组蛋白修饰，并在小鼠股动脉导丝损伤模型的基础上局部输注含有malat1模拟物或对照以实现血管损伤局部malat1高表达，从在体水平验证malat1对血管损伤后新生内膜形成的影响。本项目将为深入认识iPS细胞定向分化ECs的分子机制提供新的理论依据, 并为开辟针对AS及血管成形术后再狭窄等血管增殖性疾病新的治疗方法作出有益的实践探索

目的：动脉粥样硬化可导致一系列严重的血管疾病，例如冠心病，中风和周围血管疾病以及后续治疗期间的血管再狭窄。众所周知，促进血管损伤的修复一直是预防和治疗此类疾病的极为重要的治疗方法。肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）是一种表达丰富且极其保守的核长非编码RNA。近年来报道lncRNA-MALAT1参与了各种血管疾病的发病机理。血管壁的sca-1 +外膜祖细胞可能参与了这些疾病。我们试图阐明lncRNA-MALAT1在sca-1 +祖细胞分化为SMC中的调控作用并了解其潜在机制。.方法和结果：我们对受伤的股动脉小鼠进行了单细胞RNA测序，发现与对照组相比，lncRNA-MALAT1在损伤后明显下调。同时，发现sca1 +外膜祖细胞（APC）与血管修复和血管生成有关。 sca1 + APCs分离并体外培养。鉴于sca1 + APC在血管损伤和修复过程中可以分化为不同的血管细胞，因此使用TGF-β诱导它们特异性分化为平滑肌细胞（SMC）并模拟损伤状态。我们发现在TGF-β1的诱导下，细胞形态从短椭圆形变为肌细胞状纺锤体，VSMCs特异性标志物SMαA，SM22α和SMMHC的表达逐渐增加，这与以前的研究结果一致。在此过程中，还观察到了lncRNA-MALAT1的急剧下调。我们设计了一种siRNA来敲除sca1 + APC中的lncRNA-MALAT1，然后用TGF-β处理细胞。进行了qPCR和蛋白质印迹，以测量包括平滑肌α-肌动蛋白（SMA），SM22alpha和平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）在内的平滑肌细胞标志物的水平。免疫荧光染色结果一致。结果表明，敲除MALAT1促进了sca1 + APC分化为SMC。为了深入了解lncRNA-MALAT1抑制sca1 + APC分化为VSMC的机制，我们进行了蛋白质微阵列实验和KEGG分析。根据结果，Rap1信号通路最有可能参与此过程。大量研究表明，EPAC1 / Rap1途径可调节内皮屏障和血管生成。蛋白微阵列显示敲低lncRNA-MALAT1激活了EPAC / Rap1信号通路。抑制或激活该途径均可促进或抑制TGF-β诱导的从sca1 + APC向SMC的分化。.结论：Sca1阳性外膜祖细胞可分化为血管平滑肌细胞。在TGF-β1的诱导下，细胞形态从短椭圆形变为肌细胞状纺锤体，VSMCs特异性标志物SMαA，SM22α和SMM