新型诱导子青蒿酸对长春花培养物中生物碱合成的诱导与代谢调控机制研究

长春花中含有多种生物碱，其中长春碱和长春新碱是临床广泛应用的抗肿瘤药物。虽然原植物中该类生物碱的含量很低，但由于其化学合成步骤繁杂、成本极高，故长春花仍为主要药源。为解决资源匮乏问题，科学家们一直尝试利用植物细胞培养技术生产长春花生物碱，而如何提高培养物中生物碱的含量始终是难以突破的技术瓶颈。本项目旨在研究新型诱导子青蒿酸对长春花培养物中生物碱合成的诱导调控机制。我们前期实验首次证明：青蒿酸可诱导长春花培养细胞中生物碱大量合成，且生成的长春质碱是水杨酸诱导生成量的5.4倍。本项目拟在此重大发现基础上，采用青蒿酸诱导子提高长春花培养物中生物碱含量，采用正交设计法等优化其诱导和培养条件；对生物合成过程中相关中间体和产物进行定量测定，分离和鉴定重要中间体；对生物合成途径中相关酶/基因表达调控进行系统研究，从分子和基因水平阐述其诱导调控机理，为新型诱导子青蒿酸应用于药用生物碱的生产提供科学依据。

项目考察了青蒿酸作为新型诱导子对长春花悬浮细胞、长春花试管苗、长春花干细胞生物碱合成的影响及可能的作用机理。在长春花悬浮细胞中加入青蒿酸诱导后，文多灵、长春质碱和长春碱的含量分别为对照组的6.00, 4.95倍和2.23倍。RT-PCR结果显示，青蒿酸的加入能够上调色氨酸脱羧酶（TDC）、裂环马钱子苷合成酶（STR）、香叶醇10-羟化酶（G10H）、水苷草碱16-羟化酶（T16H）和脱乙酰氧基文多灵4-羟化酶基因（D4H）的表达。 在长春花试管苗中加入10mg/L青蒿酸诱导24 h后，长春花无菌苗叶片细胞气孔明显张大；长春花无菌苗中总生物碱、文多灵、长春质碱和长春碱的含量在诱导前期得到不同程度的提高,总生物碱、文多灵、长春质碱、长春碱的含量分别为对照组的1.30、1.13、1.45、1.88倍，证明了青蒿酸对长春花无菌苗生物碱存在诱导作用。在长春花干细胞中添加5-10mg/L的青蒿酸有利于体系中文多灵、长春质碱的合成。qRT-PCR显示，青蒿酸可显著诱导ORCA3的表达。从长春花悬浮细胞防御系统的角度，考察青蒿酸诱导作用时发现，青蒿酸使长春花细胞内发生了氧迸发现象，体系中的抗氧化酶（CAT、POD）进而被激活。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性也迅速提高。且PAL活性的提高和长春质碱的增加存在一定的时间关联性。该项目表明，青蒿酸作为新型诱导子是通过激活长春花细胞培养体系的防御系统而促进生物碱的合成。