构象靶标免疫治疗重建阿尔茨海默病线粒体自噬平衡及改善海马环路病变的基础研究

Alzheimer's disease (AD) is one of the refractory disorders because its pathogenesis is poorly understood. Based on the Abeta oligomer theory and research work in our group, we raised the hypothesis that the neuronal cytotoxicity to mitochondrial can be neutralized by conformation targeting immunotherapy, which may avoid the imbalance in mitochondrial dynamics and induce the rebalance in mitophogy, ultimately improve the pathological impairement in hippocampal circuit. In this program, we plan to analyze this mechanism at two levels, animals and cells. The conformational selective MAb A8 and control antibody were established in our own lab. Morris Water Maze test will be carried out to study behaviral effective; Mitochondrial fusion/fission protein, Abeta oligomer level and cytosolic p-tau will be detected by immunohistochemistry and western blot; LC3-I/II will be localized and colocalized with mitophagysome by IF; ultra micro pathology, mitochondrial mophology and autophagysome will be detected by TEM. Therefore, we may draw a conclusion that the effects of conformation immunotherapy have the sepecificity while control antibody does not have. The function domain may be in the variable region and the Fc fragment is not necessary. We hope to provide supports and new strategy to solve the bottle neck in AD therapy.

阿尔茨海默病（AD）的防治是目前科学难题之一，与其发病机制不清密切相关。结合前期Abeta寡聚体的基础研究和免疫治疗工作基础，提出假设：构象靶标单抗中和Abeta42寡聚体的毒性，阻断寡聚体诱导的线粒体动力失调，重建线粒体自噬平衡，从而有利于改善海马环路功能。拟选择自主研究获得的构象选择性单抗A8，以线性表位单抗为对照，开展整体水平研究；以A8单链抗体的胞内和胞外作用进行细胞水平研究。用Morris水迷宫检测行为学指标；分离提纯线粒体，通过免疫组化和蛋白印迹技术检测海马线粒体动力学蛋白表达，线粒体可溶性Abeta寡聚体水平及其引起细胞内磷酸化tau改变；用免疫荧光的方法观察LC3-I/II转位及与线粒体自噬泡的共定位；用透射电镜检测突触超微病理、线粒体形态及自噬体。明确构象靶标抗体作用的特异性，揭示其作用的主元件是抗体可变区序列，不依赖Fc段。以期为AD防治的新策略及机制研究提供实验依据。

阿尔茨海默病（AD）的防治是目前的科学难题之一，与其发病机制不清不无关系。课题组前期工作对Abeta寡聚体的生物学性质和Abeta靶向的免疫治疗做了初步的研究。在此基础上，本课题的假说是：构象靶标单抗中和Abeta42寡聚体的毒性，阻断寡聚体诱导的线粒体动力失调，重建线粒体自噬平衡，从而有利于改善海马环路的功能。在课题实施过程中，首先建立了Abeta线粒体自噬的细胞模型，探讨了Abeta寡聚体诱导的线粒体动力蛋白异常、线粒体形态异常以及自噬通量的失调控；然后，选择自主研究获得的构象选择性单抗A8，以线性表位单抗为对照，开展AD模型小鼠的整体水平研究；通过A8单链抗体（scFv）的胞内和胞外作用机制来进行细胞水平研究。结果表明，Morris水迷宫检测显示了A8治疗后模型小鼠行为学的改善；免疫组化和蛋白印迹技术显示了线粒体动力蛋白表达受可溶性Abeta寡聚体水平的调控，以及细胞内tau蛋白磷酸化的改变；同时，伴随线粒体自噬调控效应，免疫荧光显示LC3-I/II转位、p62代谢及与线粒体自噬泡的共定位；透射电镜观察显示了免疫治疗后海马区突触数量增加、线粒体形态改善以及线粒体自噬的减少。最后，构建了A8的单链抗体，结果表明不含Fc段的A8 scFv，既能够调控Abeta聚集，又能够调控其解聚，同时改善Abeta寡聚体的细胞毒性。研究提示构象靶标Abeta抗体作用的特异性，揭示其作用的主元件是抗体的可变区序列，不依赖Fc段。项目发表SCI论文4篇，中文核心期刊7篇，获得授权中国专利2项，以上成果将为AD防治的新策略及机制研究提供实验依据。