宫颈癌放疗抵抗相关microRNA的筛选及功能研究

The molecular mechanism of cervical cancer radioresistance is still unclear. Cureently, researchers have yet to find the specific regulators in radioresistant cervical cancer, and miRNA mediated resistance mechanism of cervical cancer radiotherapy has not been reported. Previously, we studied radioresistant miRNA in cervical cancer HeLa cell line and its paired radioresistant cervical cancer HeLa-R cell line, using miRNA array, and obtained 40 differentially expressed miRNA. However, the genetic background of a single cell line does not truly reflect the really radioresistant mechanisms in vivo tissues. Therefore, this project intends to further screening the candidate miRNA in other cervical cancer cell lines and to validate those miRNAs in clinical samples with Northern blot and qRT-PCR analysis. For those candidate miRNAs, we want to package their adenovirus, to observe whether those miRNAs could eliminate or reverse the radioresistant phenotype, and to further explore the possible target genes and regulatory pathways and to lay the foundation for individual treatment with cervical cancer patients.

宫颈癌放疗抵抗的分子机制尚不清楚。目前尚未发现宫颈癌放疗抵抗的特异性调控分子，而miRNA介导宫颈癌放疗抵抗的机制更尚未见文献报道。我们在国际上率先利用microRNA array对宫颈癌放疗抵抗相关miRAN进行了研究，发现相对其亲本细胞系HeLa，40个miRNA在宫颈癌放疗抵抗细胞系HeLaR中差异表达。然而，单一的细胞系遗传背景不能真实反映体内组织放疗抵抗机制。因此，本项目在我们前期工作基础上，进一步在多种配对放疗敏感差异细胞系中进行筛选，并在临床组织标本中进行Northern blot和qRT-PCR分析验证。对筛出的与宫颈癌放疗抵抗密切相关miRNA，构建并包装其相应的腺病毒，外源性改变其在宫颈癌放疗抵抗细胞中的内源性表达水平，观察是否可消除或逆转宫颈癌放疗抵抗细胞的放疗抵抗，并进一步探讨其可能调控的靶基因及其参与的分子生物学通路，为临床上宫颈癌患者个体化治疗奠定实验基础。

放射治疗是宫颈癌治疗的重要手段，肿瘤固有的放射敏感性与宫颈癌放疗后临床预后密切相关。MiRNA分子业已证实参与肿瘤的放疗抵抗，我们前期发现在宫颈癌细胞系HeLa及其放疗抵抗细胞系中，多个miRNA分子表达显示差异。本课题在前期工作基础上，通过芯片重复筛选，筛选出5个与宫颈癌细胞放疗敏感性相关的miRNA分子，其中2个在放疗敏感组织中表达上调（miR-4778-3p，miR-375），3个表达下调（miR-658、miR-431-5p及miR-216a），进一步通过在放疗敏感及放疗抵抗的临床组织标本中进行miRNA分子表达水平验证，最终选择两个与放疗敏感相关的miRNA分子（miR-4778-3p及miR-375）进行进一步功能学研究及初步机制研究。我们通过构建含有目标序列的载体，并进行腺病毒包装，将含有目标序列的病毒载体转染至宫颈癌细胞系HeLa及SiHa细胞系中，通过体外细胞功能学试验发现，在宫颈癌细胞系中，上调miR-4778-3p及miR-375分子的表达水平后，经辐照后细胞活力、克隆形成能力显著下降，且细胞迁移能力显著减退，但并未观察到明显的细胞凋亡及周期改变，但细胞坏死明显增加。进一步我们对miR-4778-3p的下游调控靶基因进行了预测和分析，通过报告基因实验及Western实验确认，miR-4778-3p可以负性调控下游靶基因med19及NR2C2，但miR-4778-3p是否通过负性调控med19或NR2C2发挥调控细胞放疗敏感性的作用，其他miRNA分子与miR-4778-3p之间是否存在共同调控作用，miR-4778-3p的上游调控分子是什么，仍然需要进一步的深入研究。