调节性T细胞对脓毒症免疫抑制的影响——膜结合TGFβ1依赖促凋亡机制

天然调节性T细胞（Treg）异常活化与淋巴细胞过度凋亡同为脓毒症特征，且均与免疫抑制相关，而新近研究发现Treg具有调节靶细胞凋亡的能力，因而两者间可能存在密切联系。为此，本项目拟通过分析脓毒症对Treg表型、促凋亡和抑制活性的影响，证实Treg诱导效应T细胞（Teff）凋亡是造成脓毒症淋巴细胞过度凋亡的重要机制; 然后，结合阻断策略，检测Treg膜结合转化生长因子(TGF)β1表达，Teff TGFβR下游信号、增殖和凋亡变化，证实Treg以膜结合TGFβ1机制发挥促凋亡效应；进而分析Treg对Teff内Smads活化、Smads与Bim、Bmf启动子结合，Bim和Bmf表达、线粒体膜电位和凋亡等影响。从胞膜-胞浆-胞核信号水平系统阐释Treg促凋亡效应的分子机制。本项目的实施将有助于揭示脓毒症Treg变化和淋巴细胞凋亡间的内在联系，对深入理解脓毒症发病机制及指导有效治疗均具有重要意义。

本项目拟通过分析脓毒症中Treg凋亡调节活性的变化，及其促效应T 细胞(Teff)凋亡的分子机制，探讨Treg功能状态异常变化与淋巴细胞过度凋亡间的可能联系和意义。本课题采用盲肠结扎穿孔(CLP)所致脓毒症小鼠模型，免疫磁珠法分选脾脏Tregs、Teff，流式细胞仪检测Treg标志物的表达水平；并将Treg与Teff共培养，流式细胞术检测Treg对Teff增殖、凋亡的影响，RT-PCR、流式细胞术检测Teff内转化生长因子(TGF)-β及膜表面TGF-β1表达水平；然后采用抗TGF-β抗体预处理，观察Treg对Teff的凋亡率、线粒体膜电位变化以及胞内Smad2、磷酸化Smad2(P-Smad2)、Bim、Bcl-2蛋白水平影响的改变。体外培养Treg以内毒素刺激后加入血必净注射液进行处理，或CLP模型小鼠给予血必净注射液治疗，观察Treg功能状态改变及对辅助性T细胞(Th)功能漂移和功能分化的影响。实验结果显示，脓毒症可诱导小鼠脾脏Treg上CTLA-4、Foxp3表达显著上调，对Teff增殖的抑制效应增强，并促进Teff凋亡增加。抗CD3/CD28抗体刺激后Treg TGF-β1m+及其基因表达明显上调。与CLP小鼠脾脏Treg共培养的Teff凋亡率升高、线粒体膜电位降低；胞内P-Smad2、Bim蛋白表达量增加、而Bcl-2蛋白表达量降低。抗TGF-β1抗体预处理Treg后与Teff共培养可使其凋亡率显著降低、线粒体膜电位升高、胞内P-Smad2、Bim蛋白表达水平降低、Bcl-2蛋白表达量则升高，Smad2蛋白表达水平在三组之间均未见明显差异；在一定程度上逆转Treg的免疫抑制效应，恢复Th1/Th2反应的平衡。另外，我们实验发现，血必净注射液能显著促进内毒素介导CD4+CD25+ Treg的凋亡，并呈现明显剂量-效应关系；脓毒症时CD4+CD25+ Treg凋亡率增加可减轻对Teff的抑制功能，而血必净注射液能有效促进脓毒症状态下Treg凋亡，介导Th2向Th1漂移。上述结果表明，脓毒症时Treg异常活化、抑制活性增强，可通过TGF-β1m+抑制Teff增殖，并经由Smads通路、线粒体途径介导Teff细胞凋亡。该结果为脓毒症及其他感染性疾病中Treg促凋亡机制的研究提供了依据，有助于阐明Treg在脓毒症发病中作用这一科学问题，具有重要理论实践意义。