惯性微流控的机理研究及其在分离循环肿瘤细胞上的应用

Circulating tumor cell (CTC) is a liquid biopsy opening a promising window into cancer biology. Its clinical significance includes cancer early detection, prognostic assessment, monitoring response to treatment and personalized therapy. However, the wide adoption of CTC detection in clinical setting is hindered by the great challenge of CTC isolation. The extreme rarity of CTC in peripheral blood requires any detection technique to offer series of features including high sensitivity/selectivity, high throughput processing, high purity of product, high recovery rate, preservation of biological properties et al.. While existing techniques meet some of these features, i.e., immunoselection-based approaches allowing high specificity, there are critical tradeoffs (throughput, purity, efficiency et al.). This work proposes a novel size-selective approach for CTC isolation using inertial microfluidics, which aims to provide a better solution to the grand challenge of CTC isolation. This approach takes the advantages of inertial forces interacting with cells flowing in microchannel, allowing size-selective, label-free and high-throughput cell sorting. Firstly, high speed fluorescent microscope and confocal microscope will be employed to explore the fundamentals of inertial focusing which remains unclear. Parameters (e.g. flow rate) affecting inertial focusing positions and those related to separation-size resolution will be interrogated. Subsequently, biochips for CTC isolation will be fabricated, validated and optimized using fluorescent microparticles. Validation and further optimization of the high performance system will then proceed to CTC isolation using blood sample spiked with cancer cell (e.g. MCF-7) due to different properties between cells and particles. The proposed innovative device of single inertial microfluidic biochip is expected to permit high profiles of the critical parameters (throughput, efficiency, purity, sensitivity and viability) simultaneously and thus facilitate the implementation of CTC detection in clinical routine.

循环肿瘤细胞（CTC）在癌症临床诊断和治疗上具有极其重要的意义。由于缺乏合适的分离手段，CTC检测在临床上仍无法得到广泛的使用。本项目针对CTC的提取难题，通过探索惯性微流控内惯性力对细胞的聚焦（inertial focusing）机理，研制基于惯性微流控芯片的CTC高效分离技术。项目先采用荧光微球结合高速荧光显微镜及共聚焦显微镜，深入研究不同流体和通道条件下细胞的聚焦位点及动力学过程，并结合微流道设计探索惯性系统中流速、浓度、出口匹配等因素对大小选择性分离（size-selective）分辨率的影响；在此基础上，根据聚焦位点和分辨率的研究结果，设计和优化惯性微流控芯片；最后，依据细胞的特殊性进行系统再优化，利用掺杂癌细胞（如MCF-7）的血液样本进行CTC的分离和富集实验，并通过生化分析量化分离过程对细胞生物特性的影响。通过上述研究为CTC的高灵敏度和高纯度提取难题的解决提供新颖的方案。

本项目旨在进一步探索微流体芯片内惯性聚焦现象（inertial focusing）的影响因素，以此为依据设计和优化全新的微流体细胞分选芯片，为循环肿瘤细胞的提取难题提供新颖的解决方案。由于循环肿瘤细胞的极度稀少性，高通量和高效能的分选机制是其能够广泛应用到癌症的临床诊断，预后和个性化精准医疗的关键之一。在深入研究惯性聚焦现象及其分离应用的过程中，本项目（1）首次发现微流体通道输出系统的流体阻抗比率对系统的临界分离直径（cutoff size）有决定性的影响。结合流速对惯性聚焦质量的影响，该比率可作为调控分离目标细胞的物理直径；同时由于该比率决定分离结果的体积比率，通过合理控制流速，该比率亦可用来调控目标细胞的浓度，比如富集循环肿瘤细胞。测试结果表明该用方法调节细胞浓度比用离心机更方便，省时间并能更好的保持细胞活性和生物特性。受限于惯性聚焦的发生条件，目前使用该途径分离细胞的通量已经接近极限。为打破该限制，本研究创造性的将血液动力学和惯性流体动力学进行了结合，并（2）首次观察并证实了全血流场内细胞的定向迁移。由于血液细胞间的强烈相互作用，该现象此前一直被认为不可能发生。全面分析实验结果显示该现象来源于剪切力诱导的定向扩散机理。据此设计的新型混流芯片成功实现了超高通量的癌细胞分离，打破了目前惯性分离的通量限制。考虑到实际应用中循环肿瘤细胞的稀少性，在细胞分离中目标细胞的损失应降到最低。 因此，不同于已有文献中的方法，本项目（3）首次将分离和捕获过程进行集成，成功实现芯片上的肿瘤细胞分离，捕获和培养的一站式自动化，将人为操作引起的细胞损失降到最低。最后，鉴于单细胞分析肿瘤细胞的重要性，本项目结合细胞在微流体通道内的迁移动力学（4）研究和开发了新颖的单细胞物理捕获和片上培养技术，以辅助分离后循环肿瘤细胞分生化分析。实验和分析结果显示，本项目设计和开发的微流体芯片为循环肿瘤细胞的临床应用提供了新颖高效的方法。