Ferroportin1（FPN1)基因对破骨细胞分化和功能的调控及机制研究

Osteoporosis is a human health problem worldwide,but its pathogenesis and mechanism are not fully understood.The latest literaturesuggest that iron plays an important role in regulating the balance of bone metabolism, Ferroportin1(FPN1) is the only discharge iron channel protein in osteoclasts, FPN1 plays an important role in reagulation of iron balance in osteoclasts. However,effects and mechanism of FPN1 on osteoclast regulation are not reported yet. Based on solid previous work and reasonable hypothesis,we realize the FPN1 may play an important role in the regulation of bone metabolism and osteoclasts.Therefore,We plan to konckdown or overexpress FPN1 gene in osteoclasts,,then determinate the differentiation and function of osteoclasts by using RT-PCR, Western blot, immune staining techniques and find changes of ROS, CREB/PGC-1β signaling pathway under FPN1 knockout condition,looking for the possible mechanism. We try to provide new ideas for treatment and prevention of osteoporosis.

骨质疏松是全球性的人类健康问题，但其病因、形成机制等尚未完成阐明。最新文献表明铁元素对于调节骨代谢平衡有重要的作用。Ferroportin1(FPN1)是目前发现的破骨细胞分化过程中内唯一排出铁的通道蛋白，对调控破骨细胞内铁含量有重要作用。然而FPN1是否对破骨细胞的分化和功能有调控作用及可能的机制尚无人报道。课题组在扎实的前期工作和合理的科学假设上，认识到了FPN1对于破骨细胞可能有重要的调控作用。因此我们拟在破骨细胞内特异性沉默或过表达FPN1基因，运用RT-PCR，Western blot，免疫染色等，研究不同组别的破骨细胞分化及功能的改变，并结合前期研究成果，探寻ROS, CREB/PGC-1β等信号通路的变化，寻找可能的作用机制，为研究骨质疏松的病因提供新的思路。

铁是人体内含量最高的微量元素，铁代谢的异常改变会引起相关的各种人类疾病。遗传性血色素沉着症，地中海贫血等一些会导致铁过载的疾病，会导致骨质疏松甚至病理性骨折。编码铁转运蛋白（Ferroportin ，Fpn）的基因是哺乳动物细胞中排出铁的唯一通道转运蛋白，在铁代谢平衡中具有重要作用。破骨细胞是哺乳动物最主要的吸收骨的细胞，在骨的发育和代谢平衡及体内钙平衡方便起了关键作用，同时在破骨细胞的分化过程中，对于铁的需求是逐渐增加，研究表明铁过量会促进破骨细胞的分化。为了明确Fpn基因是否对于破骨细胞的形成分化有影响及可能的机制，我们构建了在骨髓谱系细胞中特异敲除Fpn基因的小鼠模型，取其骨髓巨噬细胞进行细胞培养，观察其形成的成熟破骨细胞，通过细胞固定， Trap染色， 计数等方法证实了Fpn在破骨细胞内的的特异性缺失对破骨细胞的形成分化有着显著的促进作用。通过荧光实时定量 PCR检测了几种破骨细胞标志物， 结果显示随着破骨细胞的形成分化，其标志物显著增加， 其中 Acp5、Ctsk、NFATc1 这几种标志物明显高于阴性对照组，Ppargc1b mRNA 的表达量虽然在破骨细胞前体细胞阶段升高不具有显著性,但在成熟破骨细胞阶段其表达量显著增加。这些结果表明 Fpn 的缺失可能诱导破骨细胞分化形成过程中的多种细胞因子的活化，进而促进骨髓巨噬细胞分化形成成熟的破骨细胞。本研究又通过 Western blot 检测 Ctsk、NFATc1及 PGC-1β 的蛋白含量， 进一步证实了 RT-PCR 结果的可靠性。NFATc1 和 PGC-1β的蛋白含量随着破骨细的分化逐渐增加， 并明显高于阴性对照组。通过流式细胞仪测定骨髓巨噬细胞的增殖周期，明确了Fpn的缺失会导致骨髓巨噬细胞增殖加速。另一方面我们通过细胞内铁量的测定，发现Fpn的缺失会导致细胞内铁量的轻度蓄积，并明确了骨髓巨噬细胞内铁量增加可以上调M-CSF，活化巨噬细胞增殖通路——AKT通路来刺激破骨细胞的增殖。同时我们初步研究了不同组别小鼠的破骨细胞分化过程中线粒体代谢情况，表明线粒体代谢在某些基因组有部分显著性差异，同时线粒体产生的活性氧化物（ROS）在某些基因组也有部分差异性改变。综上所述， Fpn的缺失会促进破骨细胞分化形成。