基于体积排除微流控细胞分离芯片的乳腺癌循环肿瘤细胞分型研究

Breast cancer is one of the major malignant tumors threatening Chinese women. Normally, mortality is not caused by primary breast cancer itself, but the recurrence and metastasis of tumor. Circulating tumor cells play key roles in tumor recurrence and metastasis. It has been proved that CTCs can be detected even in early stage of many metastatic breast cancer, and the number of CTCs is related to the prognosis. Therefore, CTCs are important for early diagnosis of breast cancer, and might become new target of cancer therapies. However, knowledge about CTCs is quite limited due to its small quantity, interference of large amount of blood cells and unstable surface marker due to epithelial-mesenchymal transition. The functions and contributions of CTCs subpopulations are still unknown. In this study, microfluidic cell isolation chips based on filtration and size exclusion mechanism will be developed. CTCs from breast cancer patients will be categorized into subpopulations by tri-step processes combining microfluidic isolation, immuno-magneticbeads isolation and flow cytometry sorting. Furthermore, functions of each subpopulation will be evaluated by qPCR, immunohistochemistry, in vitro tests and xenograft.

乳腺癌是威胁我国女性健康的主要恶性肿瘤之一。原位乳腺肿瘤通常不致死，死亡病例主要是由肿瘤复发和转移造成的。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）是肿瘤转移的关键媒介。在许多会发生转移的乳腺癌早期，已经能检测到CTCs，且其数量与愈后相关。因此，CTCs在乳腺癌的早期诊断上有重要价值，且有望成为肿瘤治疗的新靶点。但由于CTCs数量稀少，受到大量血细胞干扰，部分CTCs又因上皮-间质转化而使表面特异性标记改变，导致对其研究十分有限，尚不清楚乳腺癌CTCs的亚群分布，以及各亚群在肿瘤转移中的作用和贡献度。本项目拟开发基于过滤法和体积排除原理的微流控细胞分离芯片，建立微流控分离，磁珠筛选，流式细胞仪分选的三步法CTCs分离鉴定手段，以分选乳腺癌CTCs所有亚群。在此基础上，利用基因表达分析，表面抗原分析，体外培养和异种移植等手段，比较各亚群的功能差异。

乳腺癌已成为全球发病率最高的肿瘤之一，也是许多国家导致女性死亡的恶性肿瘤中占比最高的。原发的乳腺癌通常不会致命。绝大多数乳腺癌死亡病例都是由于肿瘤的复发和转移造成的。原位肿瘤上会持续脱落细胞，其中一部分能进入血液循环系统，成为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）。绝大多数循环肿瘤细胞会在短时间内死亡，但也有少部分能逃避免疫系统的攻击并存活，最终形成转移灶。因此，深入了解CTCs的形成和转移机制，对开发乳腺癌早期诊断方法和新型治疗方法有重要意义。然而，虽然CTCs的研究取得了许多进展，但其临床转化始终受到很大制约。这主要是由于血液中CTCs的数量十分稀少，且有大量血细胞干扰，阻碍了对CTCs的深入研究，也导致一些CTCs检测指征与临床结局相矛盾的情况出现。本项目开发了一种基于体积排除原理的新型微流控单缝双槽四通道细胞分离芯片，以快速去除血液样本中的血细胞，富集CTCs。该芯片易于制造加工，成本低廉，使用简便，且分离过程对细胞几乎没有损伤。富集后的细胞可以进一步体外培养扩增。本项目还建立了一种CTCs体外扩增的方法，获得了大量的CTCs。在此基础上，团队全面比较了CTCs亚群和原位亚群在细胞形态，细胞功能。发现CTCs亚群也具备无限增殖和成瘤的能力，但失去了侵袭细胞外基质的能力。进一步的转录组测序证实，CTCs亚群和原位亚群是同一种细胞的不同亚群，且通过富集分析和蛋白网络分析，确定了与CTCs亚群高度相关的分子通路。本项目开发的CTCs分离芯片和体外扩增方法在临床研究领域有很广阔的应用前景。判断乳腺癌患者是否会发生转移是一项重大的临床挑战。本项目成果能够为开发肿瘤转移早期诊断方法，以及抗转移的新型治疗方法提供有力的支持。