枯草芽孢杆菌BAB-1挥发性抑菌物质相关基因的克隆与功能分析

Volatile organic compounds (VOCs) which showed antifungal activities are a class of antifungal substances produced by Bacillus subtilis, which played a significant role in control of plant diseases. Previous studies showed that the VOCs produced by B. subtilis BAB-1 exhibited strong antagonistic activity toward Botrytis cinerea and effective control of tomato gray mold. In order to clarify the major antifungal substances of VOCs and the role of various components in the disease prevention, the composition of VOCs will be identified by GC-MS. The antifungal activity and the control effect against the disease of synthetic organic volatile standard substances will be evaluated in vitro and in vivo. The biosynthetic pathway of active compounds will be cleared through KEGG pathway analysis, and the synthesis-related genes of active compounds will be selected combined with analysis of complete genome sequence of strain BAB-1. The related genes which affect the production and regulation of VOCs will be finally determined by gene in-frame deletion and complementation of target genes combing with the inhibitory activity and disease prevention. The results of the project will help to understand antifungal mechanism and enhance genetic modification of strain BAB-1.

具有抑菌作用的挥发性物质（volatile organic compounds，VOCs）是枯草芽孢杆菌产生的一类重要活性物质，可有效防治作物产中和产后病害。前期研究发现枯草芽孢杆菌BAB-1产生的挥发性物质对番茄灰霉菌的生长抑制作用很强，并可显著防治番茄叶部和果实灰霉病的发生。为明确BAB-1菌株挥发性物质中抑菌活性成份及各成分在防病过程中的地位，本项目通过GC-MS方法在明确挥发性物质成份的基础上，采用活体和离体评价方法确定主要挥发性抑菌物质；通过KEGG通径分析明确其活性成份的合成途径，结合BAB-1菌株全基因组序列分析，明确主要活性成份合成相关基因（目的基因）；通过对目的基因进行定位突变与互补分析，结合抑菌测定和防病试验，最终确定影响BAB-1菌株挥发性抑菌活性物质产生和调控的相关基因，为进一步明确该菌株的防病机制奠定理论基础，为目标菌株的定向遗传改良提供科学依据。

枯草芽孢杆菌BAB-1所产生的脂肽类及挥发性抑菌物质在其生防效果中发挥重要作用。本项目围绕（1）枯草芽孢杆菌BAB-1挥发性物质抑菌作用与相关机制；（2）营养物质对菌株BAB-1生长、芽孢形成及脂肽类物质产生的影响以及（3）菌株BAB-1的ARTP（常压室温等离子体）诱变育种等方面开展了工作。在前期研究明确菌株BAB-1挥发性物质组成的基础上，本研究评价了12种挥发性物质标准品的抑菌作用，明确其中甲酸、丙酸、正丙胺、二甲胺及二甲基二硫对番茄灰霉菌具有较强的抑制作用，并能够有效防治番茄叶片与果实灰霉病；这5种物质能够显著抑制番茄灰霉菌孢子萌发并造成菌丝畸形、断裂，从而抑制灰霉菌的生长；研究抑菌作用方式发现甲酸、丙酸、正丙胺及二甲胺对番茄灰霉菌具有杀死作用。通过表型芯片技术（Phenotype Microarrays，PMs）分析了适合菌株BAB-1细胞生长的营养物质及渗透压和pH等生长环境条件，发现该菌株能够利用114种碳源、228种氮源、29种磷源及29种硫源作为其营养物质，其中30种碳源、15种氮源、3种硫源及1种磷源能明显促进菌株BAB-1的细胞生长；葡萄糖与氯化铵分别是菌株BAB-1生长的最适碳源与氮源，熊果苷与L-脯氨酸则能促进该菌株芽孢提前形成；葡萄糖与熊果苷利于菌株BAB-1脂肽类物质fengycin的产生，且熊果苷能够显著提高该菌株surfactin的产量；L-谷氨酸钠与L-天冬酰胺利于该菌株fengycin与surfactin的产生。利用ARTP技术构建了菌株BAB-1的突变子库；筛选获得与野生型菌株BAB-1相比菌落形态发生变化的突变菌株9株，抑菌作用降低的突变菌株8株；通过比较基因组学技术与生物信息学分析，发现抑菌作用降低的突变菌株B5中acetyl-CoA C-acyltransferase（yhfS）基因发生碱基缺失突变；利用转录组测序（RNA-Seq）对菌落形态改变且抑菌作用降低的突变菌株7B3与菌株BAB-1转录基因表达情况进行研究，获得306个差异表达基因，其中198个下调基因，108个上调基因，下调基因的功能主要涉及鞭毛蛋白的合成以及莽草酸途径。以上研究结果有助于深入明确枯草芽孢杆菌次生代谢产物的抑菌机制，同时为进一步深入分析菌株BAB-1的生防机制提供科学依据。