枯草芽孢杆菌S-16菌株抑制核盘菌菌核形成挥发性物质的鉴定及其相关功能基因的克隆

Sclerotium blight is one of the most severe diseases affect sunflower production worldwide. Farmers are still lack of effective measures to suppress the disease. Bacterial strain S-16 was isolated in our previous research project and showed a high efficiency to protect sunflower against sclerotium blight. S-16 was identified as a strain of Bacillus subitilis and produced a range of antifungal compounds, some of them are volatiles which strongly inhibited the sclerotia formation. This project focuses on the molecular structure identification and anti-fungal property analysis of the volatile compounds, and further cloning and functional analysis of the genes involved in the volatile biosynthesis. Based on the genetic understanding of the volatile biosynthetic pathway, molecular genetic measures will be employed to improve the volatile production in strain S-16. Biochemical and genetic studies of anti-fungal volatile compounds will help us better understand the biocontrol mechanisms during the interaction between Bacillus agents and pathogenic fungi.

向日葵菌核病是世界上向日葵生产上的重大病害之一，目前无有效的防治措施。生防细菌S-16是本项目组在向日葵菌核病生物防治研究多年的基础上，筛选得到的可有效防治菌核病发生的生防菌株。前期研究表明，S-16菌株属于枯草芽孢杆菌（拉丁名？）。菌株S-16可产生多种抗菌物质抑制向日葵菌核病病原菌，另外其产生的可抑制核盘菌菌核形成的挥发性物质也是该菌的主要的生防机制之一。本项目着重研究菌株S-16产生抑制菌核形成的挥发性物质，明确其分子结构和抑菌功能；并利用分子遗传学手段解析编码挥发性物质的相关功能基因。以此为基础，本研究将利用遗传学手段进一步提高S-16菌株中抑制菌核形成的挥发性物质产量，为构建高效工程菌株提供理论依据；本研究也是对枯草芽孢杆菌生防机制研究的进一步补充，具有理论意义。

向日葵菌核病是世界上向日葵生产上的重大病害，目前仍无有效的防治措施。生防细菌S-16（Bacillus subtilis）是本项目组筛选得到的防治菌核病的高效菌株。本项目着重针对S-16菌株产生抑制菌核形成的挥发性物质进行研究，对其抗菌活性物质的理化性质、气体抑菌物质的组分、不同的培养条件对核盘菌生长影响等进行研究；构建突变子库；同时对突变子的生物膜的形成能力进行了研究。目的是找到抑菌物质产生的相关基因，为枯草芽孢杆菌工程菌的改造提供一定的理论依据。.本研究构建了3000个突变子库，并从中筛选到了3株丧失抑菌能力的突变子；同时也筛选到1株丧失产生气体抑菌物质的突变子。通过染色体步移方法，克隆到插入位点全长基因，并分别命名为BacX， BacX编码合成一个具有90个氨基酸，分子量约为10,105Da的肽链。在BacX基因的上游有一个转录方向相同的gmk基因，该基因是编码鸟苷酸激酶。而下游是spoT基因，转录方向与BacX相同，spoT基因是编码焦磷酸酶，参与调节（p）ppGpp在细胞内的水平，通过对该基因功能验证，证明该基因对菌核的形成具有一定抑制能力。探究气体抑菌物质的组分。1-Butanamine, N-methyl-（N-甲基正丁胺）、2-Hexynoic acid（乙炔酸）、3-Butenamide（正丁胺）、Cyclobutanol（环丁醇）、2-Octanamine（正辛胺）和Benzothiazole,2-methyl-（2-甲基苯并噻唑）能够完全抑制核盘菌菌丝的生长。Formamide, N-ethyl-N-phenyl-（N,N-二甲基甲酰胺）、Piperazine, 2-methyl-（2-甲基丙酰胺）影响菌丝正常生长，造成菌丝黄化，但是并不影响菌核形成。Ethyne, fluoro-（十二烷基甲铵）和3,3–Dimethyl-4-methylamino –butan -2-one（3,3-二甲基-4-甲氨基丁酮），对核盘菌菌丝和菌核影响较小，只是造成菌丝稀疏，但是不会影响菌核的形成。抑菌气体中含有多个可以抑制核盘菌菌丝和菌核形成的成分。.对S-16的抑菌物质理化性质的研究表明，S-16的抑菌物质的热稳定性较高，对蛋白酶较为稳定，较耐酸不耐碱，紫外照射处理对于抑菌活性的影响不明显，初步推断枯草芽抱杆菌S-16的抑菌物质的主要成分为脂肽类物质。