侧孢短芽孢杆菌B8抑菌物质作用机理及活性相关基因克隆

侧孢短芽孢杆菌是一种新型生防菌，具有杀虫、抗菌、杀线、溶磷、降解有机污染物及抗肿瘤等功能。各国报道该菌主要功能是杀虫活性，它产生的抗菌物质则用于防治临床上产生抗药性的革兰氏阳性菌和念珠菌。目前，该菌对植物病原菌的抑菌活性却鲜有报道，活性相关基因也尚属空白。本研究室分离到一株对疫霉菌（Phytophthora spp.）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等土传病原菌具有强烈抑制作用的侧孢短芽孢杆菌B8，初步研究表明该菌可产生蛋白或多肽类抑菌物质。本研究拟采用柱层析及高效液相色谱等技术分离、纯化B8产生的抑菌物质，对其结构进行解析，明确其理化性质，研究其抑菌的作用方式，探讨抑菌物质在植物上诱导抗性的信号传导途径，从而明确侧孢短芽孢杆菌抑制植物病原菌的作用机理。并克隆该菌的抑菌活性相关基因，为更加简便的利用或推广侧孢短芽孢杆菌这类新型植物病害生防菌提供理论指导。

侧孢短芽孢杆菌是一种多功能菌，目前对其抑菌活性知之甚少，相关功能基因研究也尚属空白。侧孢短芽孢杆菌B8对疫霉菌和立枯丝核菌等土传病原菌具有很强的的抑制作用，极具研究价值。本项目针对菌株B8摇瓶发酵条件、抑菌物质的分离纯化、抑菌机理、活性相关基因的克隆、表达及活性功能域展开了系统的研究。取得的主要成果如下：.（1）优化了菌株B8摇瓶发酵条件。通过单因素试验和正交设计试验对其发酵条件进行了优化，优化后抑菌活性物质比原来提高了27.5%，为抑菌物质的分离纯化奠定了基础。.（2）分离纯化获得了11.2kDa的抑菌蛋白和77.6 kDa的几丁质酶。菌株B8产生的抑菌物质具有较好的热稳定性；对酸碱、紫外光和日光照射稳定。经硫酸铵沉淀、薄层层析、Pharmadex LH-20柱层析、高效液相色谱法分离获得一种抑菌蛋白，经SDS-PAGE分析分子量约为11.2kDa，质谱分析表明在NCBI蛋白库中没有明确的匹配结果，推测可能是一种新的物质；同时采用胶体几丁质亲和吸附法，获得分子量约为77.6 kDa、具有抑菌活性的几丁质酶。.（3）明确了菌株B8胞外抑菌物质对立枯丝核菌和辣椒疫霉菌的抑菌机理。该抑菌物质可以有效地抑制辣椒疫霉菌和立枯丝核菌菌丝生长，破坏菌体细胞膜透性，使细胞内原生质体囊泡化，细胞膜消融，菌丝体消解；抑制辣椒疫霉菌游动孢子囊的产生，抑制游动孢子萌发；对立枯丝核菌菌核形成的抑制率达到100%，并延迟菌核的萌发。 .（4）首次克隆获得了菌株B8的几丁质酶基因，编码序列为2181bp，提交到 GenBank，登录号为: gb|KJ027537.1|。菌株B8的几丁质酶基因编码726个氨基酸的蛋白，其结构域包括具有典型几丁质酶的GH18-chitinase和ChiA1（几丁质结合结构域）。原核表达全长的ChiA，纯化获得约为77.6kDa的蛋白。.（5）明确了侧孢短芽孢杆菌B8的几丁质酶基因的活性功能域。原核表达ChiA的GH18-chitinase结构域，纯化获得约为45kDa的蛋白，确定其活性区域主要集中在GH18-chitinase区域，该研究填补了侧孢短芽孢杆菌的抑菌功能基因研究的空白。