短短芽孢杆菌抑菌活性物质的分离纯化和应用

前期试验结果表明，短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）JK-2菌株对番茄枯萎病的盆栽防效和田间防效分别达到了83.82%和74.70%。机理研究表明，JK-2主要通过拮抗作用来抑制枯萎病菌在番茄根部的侵染。本研究拟对短短芽孢杆菌JK-2菌株抑菌活性物质的分离、纯化工艺进行优化，明确其活性物质的组成与结构，并将提取物研制成生物农药制品应用于作物枯萎病的生物防治上，为食品安全和现代农业的可持续发展提供新的选择与保障。

生物防治具有对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，生物农药已成为全球农药产业发展的新趋势。前期发现短短芽孢杆菌JK-2具有良好生防潜能，本项目主要开展了该菌株抑菌物质分离纯化及生防制剂研究，为其在生产上的应用奠定了基础。 . 1. 通过乙醇沉淀、Q Sepharose XL阴离子交换层析、Sephadex G-50、Superdex peptide凝胶层析获得的抗菌肽，经Tricine-SDS-PAGE检测为单一条带，分子量约为3.4KD。串联质谱分析结果表明，该抗菌肽与膦丝菌素乙酰转移酶phosphinothricin-N-acetyltransferase [Streptomyces viridochromogenes DSM 40736]（gi|302549800）的部分序列匹配，覆盖率为56%。该抗菌肽对玉米穗腐病菌(Fusarium graminearum)、核桃炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)等12种供试病原真菌均具有抑制活性，抑菌谱广，耐高温，耐酸碱，耐紫外线，对蛋白酶K不敏感，对乙醚、丙酮、正丁醇等有机溶液不敏感。. 2. 盆栽防效测定结果表明，JK-2菌悬液（108cfu•mL-1）防治效果为44.0%；抗菌肽粗提液（60µg•mL-1）处理的防治效果为11.9%；菌悬液和抗菌肽粗提物混合液处理的防效为68.3%。获得了短短芽孢杆菌可湿性粉剂的配方：母粉85.0%，分散剂A11.2%，润湿剂B 2.8%，保护剂C1.0%。该制剂芽孢含量为2.6×109cfu•g-1，抗菌肽含量20µg•g-1，杂菌率0.03%，pH7.9，细度大于99%，干燥减量4.5%，润湿时间48.3s，悬浮率78.6%。依据GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》、《农药登记资料规定》，进行了毒理学试验。短短芽孢杆菌可湿性粉剂对雌、雄大鼠急性经口LD50＞5000mg•kg-1，属微毒性；对雌、雄大鼠急性经皮LD50（4h）＞2000mg•kg-1，属低毒性；对实验兔皮肤无刺激性。