短小芽孢杆菌抑菌活性相关基因的克隆及比较蛋白质组学研究

采用Tn5转座突变技术，建立短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）DX01菌株的随机插入突变库，以玉米小斑病菌为指示菌，通过抑菌试验，从中筛选抑菌活性丧失突变株；采用反向PCR法克隆突变株转座位点的侧翼序列，经染色体步移获得DX01菌株的抑菌活性相关基因序列；对该序列进行生物信息学分析，并通过功能互补和基因敲除实验以验证该基因与抑菌活性的相关性；在具有典型抑菌活性丧失表型（统计学上差异达显著水平）的突变株和出发菌株DX01之间进行比较蛋白质组学研究，利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术及蛋白质氨基酸序列数据库检索，构建生防菌DX01的抑菌活性丧失突变株的特征性蛋白质组图谱，明确其特征性蛋白质的性质及氨基酸序列，确定与短小芽孢杆菌抑菌活性密切相关的关键蛋白种类、性质和功能，为今后研究生防菌与病原菌间的互作机理、揭示生防菌的抑菌分子机制及开发微生物农药奠定理论基础。

1. 分别构建了Tn5转座载体pMOD-trpChph和Tn5-egfp-Tetr，建立和优化了短小芽孢杆菌Tn5转座子电击转化技术体系，构建了1个含有4100个转座株的突变体库，其中1467株为GFP标记突变株。通过考察细菌生长时期、电击电压、电击缓冲液及复苏培养基的选择等因素对Tn5转座载体电转化效率的影响，确定了实验室条件下的高效转化体系。2. 以玉米小斑病和水稻稻瘟病等的病原菌为指示菌，通过抑菌试验，筛选出8株抑菌活性显著变化的突变株，并测定了这些突变株几丁质酶和蛋白酶的活性，克隆了突变株转座位点的侧翼序列。3. 采用荧光酶标仪、流式细胞术检测及荧光显微镜观察等手段，对GFP表达作了定量和定性分析，筛选出8株强表达GFP且遗传稳定的突变株，并作了T-DNA插入拷贝数鉴定。在开放和封闭系统中，标记菌在水稻幼苗根际土壤中可以存活15 d以上。植株活体切片的荧光显微镜检发现短小芽孢杆菌在根毛区及侧根分生处的数量最多，并在根表面形成菌膜。该菌可通过水稻幼苗根部的伤口或幼嫩根毛等部位侵入根系，主要分布在皮层细胞及其间隙，在植物的维管束内亦可观察到荧光标记菌。研究结果表明短小芽孢杆菌在水稻幼苗根际土壤中有着良好的定殖能力。4. 对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Illumina/Solexa基因组扫描，得到了4267个基因；利用NCBI的蛋白公共数据库进行基因功能注释，得到3145个具有明确生物学功能的蛋白。测序结果发现了许多芽胞杆菌抑菌相关基因，如tasA、细菌表面活性素合成酶基因surf1、surf2、聚酮合酶基因pks5等，对这些关键基因进行了原核表达及表达产物的抑菌活性测定。对这些基因作了系统发育分析。.5. 通过Solexa基因组扫描及PCR验证，克隆了1条短小芽孢杆菌聚酮合酶基因簇(DX01pks)全序列，该基因簇组成结构与已报道的芽孢杆菌聚酮合酶基因簇明显不同，当前正在对该基因簇作进一步的结构解析及功能分析。6. 对M25和野生型菌株DX01进行了差异蛋白质组分析，通过双向电泳和质谱分析共鉴定出20个差异表达蛋白点，其中8个蛋白表达上调，12个蛋白下调。