结核分枝杆菌ESX-5分泌系统内PE/PPE蛋白免疫原性研究

PE/PPE protein family is unique to Mycobacterium, and usually exists in operons or gene clusters. Almost 10% of the genome of Mycobacetrium tuberculosis is composed of pe and ppe. Their exact functions are still generally unknown, but are strongly suspected to be involved in several aspects of host-pathogen interactions, such as antigenic variability, virulence and persistence of the bacillus. Type VII secretion system is a noval secretion system found in Mycobacterium tuberculosis in recent years. Mycobacterial genomes encode up to five of these transport systems, among of which, ESX-1 and ESX-5 are correlated with virulence. Present research mainly focuses on the ESX-1, while ESX-5 is rarely reported. ESX-5 secretion system contains the gene cluster of PPE25-PE19 and preliminary experiments show that, deletion of this cluster will lead to the virulence of Mycobacteriun tuberculosis significantly attenuated in mouse model. This project will focus on the immunogenicity of PE/PPE proteins located in ESX-5 secretion system. The desired PE/PPE proteins will be expressed by prokaryotic expression strategy and purified, and then their humoral and cellular immunogenicity will be explored by mice immunization. For the cellular immunogenicity potent protein candidates, the dominant T cell epitopes will be futher identified. As a result, this project will provide theoretical bases for the development of early diagnostic reagents and novel vaccines of tuberculosis.

PE/PPE蛋白是分枝杆菌独有的一类蛋白家族，通常以操纵子或者基因簇的形式存在，其编码基因大约占整个结核分枝杆菌基因组的10%。目前还不清楚PE/PPE蛋白的确切功能，但越来越多的研究显示，PE/PPE蛋白与结核分枝杆菌的毒力、抗原变异以及在巨噬细胞内的生存密切相关。VII型分泌系统是近年来在结核分枝杆菌中发现的一种新型分泌系统，一共有5种类型，其中与毒力相关的为ESX-1和 ESX-5，目前的研究主要集中在ESX-1上，对ESX-5的研究还鲜有报道。在ESX-5内含有PPE25-PE19基因簇，前期实验表明，该基因簇的缺失将导致结核分枝杆菌对小鼠的毒力大大降低。本项目以ESX-5内的PE/PPE蛋白为研究对象，采用原核表达策略对其进行表达并纯化，以小鼠为动物模型来评价它们的免疫原性，并对具有细胞免疫原性的候选蛋白进一步鉴定出优势T细胞表位，为开发结核病早期诊断试剂和新型疫苗提供理论基础。

VII型分泌系统是在结核分枝杆菌中发现的一种新型分泌系统，一共有5种类型，其中与毒力相关的为ESX-1和ESX-5，目前的研究主要集中在ESX-1上，对ESX-5的研究还鲜有报道。在ESX-5内含有ppe25-pe19基因簇，该基因簇的缺失将导致结核分枝杆菌对小鼠的毒力大大降低。本项目对ESX-5内的PE/PPE蛋白的免疫生物学特性进行了研究。.通过大肠杆菌表达系统成功表达了PPE25、PPE26、PPE27和PE19蛋白，分子量分别为40 ku、44 ku、41 ku和15 ku。纯化的PPE25、PPE27 和PE19蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7的活性有显著的抑制作用，且呈现剂量依赖性。.构建了表达ppe25、ppe27基因的重组耻垢分枝杆菌，与空载体对照菌相比，重组菌的生长曲线没有发生明显变化，但是在巨噬细胞RAW264.7内的生存能力去明显增强。亚细胞定位结果显示，PPE25和PPE27蛋白均表达于细胞的表面。.纯化的重组蛋白能有效地刺激新西兰大白兔产生特异性抗体的产生，进一步实验证实，PPE25/27: 56-71、PPE26: 370-385和PE19: 56-71 是相关蛋白的优势B细胞表位。结核病人的外周血单核细胞经PPE25/PPE26/PPE27 蛋白混合物或者PE19 蛋白刺激后，均能引起抗原特异的IFN-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子分泌，从而说明融合蛋白具有细胞免疫原性。通过表位作图的方法共鉴定出PPE25: 236-255、PPE25: 281-295和PPE25: 321-335是ESX-5分泌系统相关PPE蛋白的特异表位；PE19: 1-18为ESX-5分泌系统相关PE蛋白的特异表位。通过SYFPEITHI软件预测并进行实验验证，PPE25/27: 44-52和PPE26: 44-52是MHC-I T细胞表位。制备了针对PPE26: 44-52表位的CD8+ T细胞杂交瘤，共获得1E1、4A8 和4D8三个克隆，且MHC限制性都为H-2Kd。.通过细菌双杂交系统构建了ESX-5分泌系统内的蛋白相互作用网络，生物信息学分析发现Rv1787~Rv1792 这个区段不是ESX-5 分泌系统的核心组分。这些数据将有助于对结核分枝杆菌ESX-5 分泌机制的深入研究，为结核病的预防、诊断和治疗提供理论依据。