结核分枝杆菌PPE62蛋白抑制宿主细胞自噬体形成的分子机制

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the most successful intracellular pathogenic bacterium, is not only able to hamper maturation of phagosome or fusion between phagosome and lysosome, but also able to destroy the membrane of phagosome to get access to cytoplasm by secreting virulence factor. The incompetent phagosome membrane is one kind of signal for initiation of autophagy flow, which is capable of clearing intracellular Mtb. However, Mtb has the ability to modulate the initiation and development of autophagy in host cell depending on a series of secretory effectors. Although, it is known that the infection of Mtb inhibits autophagosome formation in host cell, our knowledge about the molecular mechanism behind it is still not enough. PPE16, secreted by Mtb, was screened and identified to inhibit autophagosome formation remarkably in the previous study in our lab. In this program, we intend to further screen and identify the target of PPE16 in host cell, and identified the activity centre for this interaction, analyzing the chemical basis of the interaction, to elucidate the molecular mechanism for the inhibition effect of PPE16 on autophagosome formation in host cell.

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）属于胞内病原菌，它不仅能阻碍吞噬泡的成熟和与溶酶体的融合，还能分泌毒力因子破坏吞噬泡膜进入胞浆。吞噬泡膜的受损将诱导细胞自噬，自噬流的发生可帮助细胞清除Mtb。然而，Mtb也可分泌效应子操控细胞自噬的发生发展。尽管已知Mtb的感染能抑制细胞自噬体的形成，但对背后分子机制的研究仍了解不多。本课题组前期工作筛选出Mtb的分泌蛋白PPE16能显著抑制宿主细胞自噬体的形成，本项目希望进一步筛选鉴定出PPE16作用的宿主靶标，鉴定互作的活性中心位点，分析相互作用的化学本质，从而阐明PPE16抑制宿主细胞自噬体形成详细的分子机制。

胞内菌一个重要的致病特性是在细胞内为其生长创造并维系适宜的微环境。Mtb能对抗吞噬体的杀菌作用而在吞噬细胞内存活，对其原因的阐释，目前的研究发现主要在两个方面：（1）分枝杆菌的胞壁成分：其发挥效应主要是经由细胞表面不同的受体识别，而由不同受体介导的吞噬作用会激活不同的跨膜信号转导，致病性的Mtb引起的信号转导往往不能促进吞噬泡的酸化，从而增加胞内存活的机会。（2）分枝杆菌的分泌蛋白对宿主细胞囊泡转运系统的干扰：Mtb产生的分泌蛋白，有些可在吞噬泡内发挥作用，有些可渗透到胞浆中发挥作用，大部分参与了干扰正常囊泡转运的信号通路，从而构建了适宜Mtb存活的、特殊的囊泡微环境——MCV（Mycobacteria-containing vacuole）。. 本项目起初以Mtb PPE16抑制细胞自噬为研究对象，但未获得有价值的发现，因而转向在PE/PPE家族基因中筛选与巨噬细胞存活相关的成员。首先，构建了耻垢分枝杆菌（Msmeg）超表达PE/PPE家族基因菌株库，共获得重组菌144株。基于rMsmeg感染原代小鼠腹腔巨噬细胞的模型筛选巨噬细胞内存活相关的PE/PPE家族成员，筛选到胞内菌数均持续增加的6个相关基因，分析了这6个基因产物在分枝杆菌中的亚细胞定位，发现2、3、4和5号基因产物都能被分枝杆菌转运至菌体外。在细胞感染模型中，我们检测到重组菌引起感染巨噬细胞的死亡，电镜观察被感染细胞的崩解的超微结构变化，其中2号基因引起的细胞死亡比例最高。分析2号基因重组菌感染巨噬细胞的死亡类型，用Western-blot的方法排除了焦亡和坏死性凋亡的可能性；进一步通过在细胞模型中应用特异性抑制剂，发现2号基因超表达引起的巨噬细胞死亡类型可能以铁死亡为主。为探索重组菌不能被吞噬体杀灭的可能原因，我们用超高分辨率显微镜观察2号基因重组菌感染巨噬细胞的情况，发现重组菌可能对吞噬体的酸化有抑制作用。基于细胞模型取得的结果，我们在小鼠体内的感染试验，也进一步验证了2号和 3号基因的超表达增强了耻垢分枝杆菌的致病性。. 本项目的发现丰富了我们对Mtb分子致病机制的认识，发掘的毒力因子或可能成为结核病新药研发的靶标，或是为结核病基因缺失疫苗的设计提供思路。