结核分枝杆菌新型抗原PPE在潜伏结核感染诊断中的实验研究

Recently, diagnosis of latent TB infection is faced with some problems, for example, assays based on release of IFN-γ by PBMC exposed in vitro to M. tuberculosis-specific antigens, such as ESAT-6 and CFP-10, have emerged as attractive specific alternatives to tuberculin skin test to distinguish between M. tuberculosis infection and BCG vaccination/reactivity to non-tuberculous mycobacteria, but it cannot distinguish between latent TB infection and active tuberculosis. So there is a pressing need to detect new TB antigens to set up sensitive immunological tests that may improve the identification of latent TB. Because anti-PPE CD4+ T-lymphocyte responses showed different characteristics between .PPD+ healthy controls and active TB patients. This study will evaluate the cellular immune response to PPE during mycobacterial infection by determining the T-cell response to PPE in a small cohort of subjects by ELISpot and ICC. These results of our research will be useful for the development of new immunological diagnosis of latent TB infection, and may provide some new ideas in the prevention and treatment of tuberculosis.

目前，潜伏结核感染诊断面临着一些问题，新兴的免疫学检测方法γ干扰素释放试验（刺激抗原为ESAT-6和CFP-10）虽然解决了PPD试验不能区别结核感染引起的阳性结果和BCG接种或环境分枝杆菌感染引起的假阳性结果的问题，但是该方法仍不能区别潜伏结核感染和活动性结核病。因此，开发新型诊断性抗原是目前解决潜伏结核感染诊断困难的主要手段。由于PPE抗原特异性CD4+T细胞免疫反应在PPD阳性健康者和活动性结核病患者中表现不同，因此本研究以PPE蛋白及其肽段为主要研究对象，通过ELISpot法和ICC法分析不同免疫状态的人群PPE抗原及其肽段抗原（另设立对照组抗原如PPD、ESAT-6）刺激外周血淋巴细胞分泌γ干扰素的情况及其细胞亚群分布的情况，最终筛选出可作为后续早期诊断结核感染的最佳候选肽段抗原，同时评价ICC方法在临床实际工作中的应用价值，为结核病的防治开辟新的道路。

由结核分枝杆菌引起的结核病是当今世界上最普遍的人类传染病之一。尽管近些年来BCG疫苗已经广泛使用，但该疫苗的作用一直存在争议。此外，结核菌素皮肤试验和γ干扰素释放实验的敏感性均不理想，且不能区别潜伏结核感染和活动性结核病。因此急需发展新型的免疫学检测方法以解决目前结核诊断所面临的问题。本项目通过计算机预测结核分枝杆菌PPE家族蛋白MHC-I类和II类分子限制性CD8+T和CD4+T细胞泛宿主表位，并利用γ干扰素释放实验进行体外验证。本研究利用网上数据库提取PPE家族全部蛋白序列；然后使用生物信息学软件包括SignalP4.1，SecretomeP2.0，DAS和NetMHCII2.2等分析工具预测、筛选出MHC-I类和II类分子限制性CD8+T和CD4+T细胞泛宿主表位；最后利用γ干扰素释放实验进行合成肽段的体外实验验证其刺激激活CD8+T和CD4+T细胞的能力。结果发现，预测出的78个泛宿主表位多肽，其中25个来自于PPE8蛋白，其余来自于PPE14、PPE18、PPE42、PPE44、PPE60、PPE68、PPE12、PPE21 和PPE62蛋白。γ干扰素释放实验虽并未发现预测出的泛宿主表位多肽可刺激大量的CD8+T或CD4+T淋巴细胞产生IFN-γ的分泌，但来自于PPE8蛋白的一个泛宿主表位多肽可刺激少量的γ干扰素的分泌。本项目通过研究特异性抗原表位在潜伏结核感染诊断中的作用，为后续开发诊断潜伏结核感染的实验手段提供了一些基础数据，尤其是来自PPE8蛋白的泛宿主表位多肽，可能是下一步亚单位疫苗或诊断性标志物的重要候选抗原。但仍需进一步扩大样本量进行验证。