大菱鲆Grim19基因在细胞凋亡及病原感染防御中的作用研究

面对制约大菱鲆养殖业发展的病害问题，从基因及网络调控水平开展大菱鲆免疫抗病机制研究，对于制定分子防病策略尤为必要。细胞死亡调控基因Grim19在抑癌、抵抗细菌和病毒感染方面的重要作用，为人类疾病治疗开辟新的研究途径，对鱼类疾病防治研究也有重要启示价值。因此，本项目拟在克隆获得大菱鲆Grim19基因的基础上，以大菱鲆成体各组织、细胞系为材料，采用免疫组化、定量PCR等方法分析大菱鲆Grim19 的表达模式；研究Grim19在Stat3信号通路中的作用及对细胞凋亡的影响；采用过表达/抑制表达方法结合细菌/病毒感染探讨Grim19在抵抗病原感染过程中的作用及分子机制。作为对鱼类Grim19结构和功能的首次研究，本项目将揭示大菱鲆Grim19在细胞凋亡及病原感染过程中的具体作用，有助于深入理解大菱鲆免疫系统基因的作用机制，加快大菱鲆等药物研制及基因工程抗病育种研究的步伐。

GRIM-19作为新的细胞凋亡调控因子，在肿瘤细胞凋亡、线粒体呼吸链、结合病毒蛋白、控制病原菌入侵等方面发挥重要作用。迄今为止，鱼类中只有斜带石斑鱼GRIM-19有文献报道。本研究中，我们以重要海水经济鱼类—大菱鲆为实验材料，开展了GRIM-19基因的克隆、表达及功能初步分析。大菱鲆GRIM-19基因的cDNA全长为595 bp，编码144个氨基酸，进化树分析发现大菱鲆GRIM-19与大西洋庸鲽GRIM-19的亲缘关系最近。利用qRT-PCR技术检测该基因在大菱鲆正常组织、不同胚胎发育阶段、鳗弧菌和淋巴囊肿病毒感染大菱鲆肾脏、肝脏和脾脏组织的表达情况，发现大菱鲆GRIM-19基因在多个组织都有表达，在病原刺激可以上调该基因的表达水平。表达纯化了GST-GRIM19融合蛋白，并确定其抵抗鳗弧菌感染的活性；亚细胞定位分析表明GRIM-19和STAT3共定位于细胞质中，缺失结构域分析发现这种共定位主要是由GRIM-19的41-84氨基酸和STAT3的1-312氨基酸决定的。利用流式细胞技术确定GRIM-19诱导不同细胞的凋亡能力，其调控位点可能位于C端；通过荧光素酶报告实验初步确定了GRIM-19基因参与NF-κB途径。通过以上研究，初步揭示了鱼类细胞死亡调控基因GRIM-19在抵抗病原感染及细胞凋亡过程中的作用，为制定健康高效的大菱鲆等鱼类养殖防病策略提供重要的基础资料。本项目发表SCI文章4篇，获授权专利1项。