新型深海酯酶EstD的催化特性和适应深海低温环境的适冷机制

Lipolytic enzymes from marine bacteria play important roles in marine orgarnic carbon degradation and carbon cycle. EstD is a novel cold-adapted esterase isolated from deep-sea sedimentary bacterium, containing an Abhydrolase_5 domain. Homologous sequences to EstD are present in many genomes of marine bacteria, but these predicted sequences are not characterized up to date. To illustrate the catalytic properties, environmental adaption and ecological function of EstD, we will biochemically characterize this protein and crystallize EstD and EstD bound to ester substrate in this project. Based on structural, mutational and biochemical analysis, the mechanism for substrate recognition and catalysis of EstD will be elucidated. Moreover, by comparative structural analysis of EstD and reported thermostable homologs combined with mutational analysis, the structural basis for the thermolability of EstD will be studied and thus the mechanism for the cold adaption of EstD to deep-sea sediment will be elucidated. Finally, by analysis of environmental sequences in GOS, Tara Oceans and other marine metagenomic databases homologous to EstD, the abundance and geological distribution of EstD-like sequences and strains containing these sequences will be revealed. The above analysis combined with catalytic properties and environmental adaption of EstD will demonstrate the ecological function of this kind of enzyme. Our results in this project will illustrate the mechanism for the environmental adaption of deep-sea microorganisms and shed light on the development of deep-sea novel enzyme resources.

海洋细菌产生的酯类水解酶在海洋有机碳降解和碳循环中发挥着重要作用。EstD是一个分离自深海沉积物菌株的、含有一个Abhydrolase_5水解酶结构域的新型低温酯酶。虽然EstD的同源序列存在于多个海洋细菌基因组中，但目前尚未有研究报道。为了阐明EstD的催化特性、适冷机制和生态功能，本项目将对EstD进行酶学特性分析；解析EstD及其与底物复合物的晶体结构，通过结构分析、突变和生化分析，揭示EstD识别和催化底物的特性和分子机制；通过与类似的耐热酯酶的结构比较和突变分析，研究EstD热敏感的结构基础，揭示EstD适应深海低温环境的适冷机制。最后通过分析GOS、Tara Oceans等海洋宏基因组数据库中EstD的同源序列，阐明此类酶及其产生菌在海洋中的丰度和地理分布，再结合实验结果阐明此类酶的生态功能。项目研究结果将为阐明深海微生物的环境适应机制和深海新型酶资源的应用开发提供重要依据。

海洋细菌产生的酯类水解酶在海洋有机碳降解和碳循环中发挥着重要作用。EstD是一个分离自深海沉积物菌株的新型低温酯酶。虽然EstD的同源序列存在于多个海洋细菌基因组中，但是关于这类酶的催化机制及生态功能目前还不清楚。系统发育分析显示，EstD及其同源蛋白独立聚簇，表明EstD及其同源蛋白代表了一个酯类水解酶新家族，该家族与酯类水解酶第IV家族的亲缘关系更近。我们对EstD及其同源蛋白进行了生化表征。生化分析表明，EstD及其同源蛋白的底物选择性不同于已报道的第IV家族酯酶。EstD及其同源蛋白偏好降解较小的酯类底物pNPC2，而已报道的第IV家族酯酶则偏好降解较大的酯类底物pNPC4-pNPC12。此外，EstD及其同源蛋白在0-10℃低温仍保留10%-30%的酶活，表现出低温酶的特征。随后，通过晶体结构解析，获得了EstD同源蛋白——E41的部分晶体结构，再结合同源模建，获得了E41的完整结构。E41的催化三联体由Ser148、Asp230和His253组成，E41对酯类底物的水解依赖于催化三联体。不同于第IV家族酯酶，E41不含有cap结构域，只含有一个催化结构域。相较于第IV家族酯酶宽而深的催化腔，E41的催化腔窄又浅且催化腔底部带有较多的正电荷，这导致了E41的底物选择性不同于第IV家族酯酶。结构分析还揭示出，E41含有多个长的柔性loop，尤其是活性中心具有较高的柔性，这可能促成了该酶在低温下具有较高的催化效率。E41同源序列广泛分布在γ-变形菌纲的Glaciecola、Alteromonas、Pseudoalteromonas以及放线菌纲的Catenulispora和Rhodococcus，表明酯酶E41在这些海洋细菌中发挥着重要的生理作用，有助于其来源菌更好地适应海洋极端环境。对EstD及其同源蛋白E41的研究，有助于阐明深海微生物的环境适应机制。