深海来源β-半乳糖苷酶的定向进化和适冷机制研究

Cold-adapted enzymes have wide application prospects because of their high catalytic properties at low temperature. Low temperature and oligotrophic deep-sea extreme environment are important sources of cold-adapted enzymes. In the previous work, four homology β-galactosidase genes were obtained from deep sea. The enzymatic properties of the genes proved that the encoding β-galactosidases are cold-adapted enzymes. Cold-adapted β-galactosidase has an important application in food industry, especially in the production of lactose-free milk. At present, the research on cold-adapted β-galactosidase mainly focused on the nature of natural enzymes, while the molecular modification and cold-adapted mechanism are rarely reported. In order to further improve the catalytic efficiency of cold-adapted β-galactosidase at low temperature, the relationship between the structure and catalytic properties of cold-adapted β-galactosidase was studied. In this project, a mutant library of cold-adapted β-galactosidase will be established by directed evolution based on family shuffling. After screening, the cold-adapted β-galactosidases will have higher catalytic efficiency under low temperature. The properties of enzymes will be determined and the cold-adapted mechanism will be researched from catalytic kinetics and molecular structures. To search the key structures and sites of cold-adaption and deepen the understanding of the catalytic mechanism of cold-adapted enzymes.

适冷酶因其低温下的高催化特性，具有广泛的应用前景，而低温、寡营养的深海极端环境是适冷酶发现的重要来源。在前期工作中，申请人从深海中获得了四种同源的β-半乳糖苷酶基因，酶学性质研究证明其编码的β-半乳糖苷酶为适冷酶。适冷β-半乳糖苷酶在食品工业特别是无乳糖牛奶生产中有着重要的应用。目前，对于适冷β-半乳糖苷酶的研究主要集中在天然酶的性质研究上，而分子改造和适冷机制研究报道较少。为了进一步提高适冷β-半乳糖苷酶低温下的催化效率，研究适冷酶的结构与催化特性之间的关系。本项目提出了如下研究思路：以深海来源的同源β-半乳糖苷酶基因为研究对象，利用基于基因家族改组的定向进化策略，筛选得到低温下高活力的适冷β-半乳糖苷酶突变体；研究适冷β-半乳糖苷酶突变体的酶学性质，从催化动力学和分子水平上探讨适冷机制，寻找适冷性相关的关键结构和位点，加深对适冷酶的催化机制的理解。

深海是典型的恒温冷环境，蕴含着丰富的微生物基因资源，是适冷酶的主要来源之一。本项目以四种深海来源GH2家族β-半乳糖苷酶基因为起始模板，利用基于简并寡核苷酸改组法的基因组装法构建了GH2家族适冷β-半乳糖苷酶基因文库。通过对基因文库的筛选获得了9种基因嵌合体序列，这些序列均能从四种野生型β-半乳糖苷酶基因中找到来源，且基因嵌合体库的形成是相对随机的。这种有控制的家族基因进化的方法能提高有效突变体的比例，从而提高基因进化速率。随后对两种突变体M22和M250分别进行了异源表达和纯化，并完成了酶学性质的研究。与野生型酶相同，这两种突变体的最适温度均为35oC，属于适冷酶；最适pH均为8；均能够水解β-半乳糖苷类底物，对α-糖苷类和其他糖苷类底物无活性，具有高度底物专一性；Zn2+和Cu2+均能显著抑制酶的活性。这种可控的基因改组方法保留了酶的基本结构，使突变体保留了与野生型相似的酶学性质。与野生型不同，Mg2+和Mn2+是突变体M22和M250的强激活剂；突变体M250的底物亲和力高于野生型酶，但催化效率远远低于突变体M22以及野生型酶；突变体M250具有转糖基活性，生成低聚半乳糖产物，在益生元的生物合成中具有较高的应用前景。通过对不同来源β-半乳糖苷酶的比较，进一步阐明适冷β-半乳糖苷酶的适冷机制。在一级结构上，菌株ML117来源和Arthrobacter psychrolactophilus来源适冷β-半乳糖苷酶均倾向于结构小的氨基酸(甘氨酸，丙氨酸等)，减少了芳香族氨基酸的数量，增加了酶分子的柔性，而在嗜热菌Thermotoga maritima来源的β-半乳糖苷酶中，谷氨酸、赖氨酸等氨基酸含量明显高于适冷和中温酶；在二级结构上，与中温和嗜热酶相比，适冷β-半乳糖苷酶酶有更高比例的片层和卷曲结构，这种柔性结构有助于提高低温下的催化效率。本项目的开展推动了深海微生物资源的开发和利用，加深了对适冷酶的适冷性催化机制的理解，为适冷β-半乳糖苷酶在低乳糖牛奶生产和低聚半乳糖益生元合成中的应用提供了理论依据。