纳米尺度耐药金黄色葡萄球菌细胞壁的超分子结构及新型M23家族金属蛋白酶Pseudoalterin对其抑制机制与应用

Developing novel antimicrobials is no longer just an option, but is rapidly becoming a necessity in the circumstances of cureless and high lethality caused by infection of antibiotic resistant Staphylococcus aureus. One important strategy to inhibit antibiotic resistant bacteria is associated with its cell wall as drug targets. Firstly, the supramolecular structure of cell wall of antibiotic resistant S. aureus at nanometer scale will be detected using atomic force microscope. Based on the establishment of the antimicrobial activity and cell wall of S. aureus as enzymatic site involved in pseudoalterin,a novel metalloproteinase of M23 family, a series of investigations will be designed with the attempt to explore the antimicrobial mechanism of pseudoalterin. These investigations include the binding of pseudoalterin on peptidoglycan, the cleavage sites on peptidoglycan and the peptidoglycan-hydrolysis mechanism of pseudoalterin. Furthermore,the degradation process of peptidoglycan and changes in its supramolecular structure will be studied to elucidate the molecular mechanism by which pseudoalterin inhibits S. aureus. Finally, animal model infected by nosocomial S. aureus with methicillin- or vancomycin-resistance will be established to analyze the stimulating response and therapeutic efficiency of pseudoalterin towards the tested animals to evaluate the clinical potential. Then the standard of administrative drug dosage will be developed for further clinical application of pseudoalterin.

耐药性金黄葡萄球菌所致感染的难治愈和高致死率，使寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫，其中针对耐药细菌的细胞壁为作用靶点，是抑制耐药性细菌的重要策略之一。本项目首先利用纳米技术- - 原子力显微镜，从纳米尺度上揭示耐药金葡菌细胞壁的超分子结构，然后明确新型M23家族金属蛋白酶Pseudoalterin对耐药金葡菌的抑菌作用及细胞壁做为作用靶点。在此基础上，系统研究Pseudoalterin在细胞壁肽聚糖上的吸附作用与机制、酶解肽聚糖的作用位点及酶解生物化学机制、酶解肽聚糖的过程及超分子结构的变化，从而阐明Pseudoalterin抑制耐药金葡菌的分子机制。最后，建立临床常见耐药性金黄葡萄球菌动物疾病模型，从Pseudoalterin对动物的刺激、治疗效果等方面进行全面测评，从而对其临床应用潜力进行评估，并建立临床用药标准，为其未来的临床应用提供依据。

本研究首先利用纳米技术—原子力显微镜，揭示了耐药性金黄葡萄球菌细胞壁在纳米尺度上的超分子结构，发现其细胞壁结构由肽聚糖纤维平行排列组合而成。建立了M23 家族金属蛋白酶Pseudoalterin 的高效制备技术，由软件Expert-Design预测菌株CF6-2分泌pseudoalterin的最优培养方案为：心管粉1.2%，培养温度20.17°C，培养时间28.04 h。在此条件下，预测发酵液的酶活可达到101.385 U/mL。研究Pseudoalterin对耐药性金黄葡萄球菌的抑制作用。在此基础上，阐明了Pseudoalterin 的对细胞壁肽聚糖的吸附的分子机制：实验结果表明由pseudoalterin 的β6-β9 这四个β 折叠形成的domain 具有与糖链相互作用的功能，其中pseudoalterin 的C 端最后20 个氨基酸在吸附作用中发挥重要的作用。发现和鉴定Pseudoalterin 在肽聚糖上的酶解位点，由于M23 家族蛋白酶对Gly-Xaa 键的偏好，pseudoalterin可以从多个位点切断五甘氨酸肽桥。另外，pseudoalterin 还可以切开肽桥与肽尾联接处Lys两侧的肽键。除此之外，pseudoalterin 对肽尾Glu 两侧的肽键可能也有酶切作用。利用AFM 技术，从纳米尺度上观察Pseudoalterin降解耐药性金黄葡萄球菌的过程和超分子结构变化，为抑菌机制的阐明提供结构基础，同时为揭示耐药性金黄葡萄球菌细胞壁的超分子结构提供依据。最后，建立了临床常见耐药金黄葡萄球菌动物疾病模型：小鼠皮肤脓肿和家兔眼角膜炎动物模型，制剂安全性测试结果表明：Pseudoalterin对动物没有毒性和致突变性，对皮肤和眼角膜的黏膜没有任何刺激性。在此基础上，使用临床标准药物万古霉素做对照，用低、中、高剂量的Pseudoalterin作为治疗药物，发现其疗效与万古霉素相近，但用量比万古霉素小，而且耐药金葡菌的感染量得到了很好的控制。并发现高浓度Pseudoalterin治疗角膜炎效果远好于临床常规药物诺氟沙星，而且比市售成品药物Lysostaphin 效果略好，用量低。动物实验模型的建立和初步疗效的观察，表明了Pseudoalterin作为一个有潜力的未来可能应用于临床的候选抗耐药性细菌药物的前景，为其广泛地临床应用奠定了基础。