CDNF蛋白二级结构中的关键α-Helix对其多巴胺能神经营养活性的影响

Cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF) is a novel evolutionary conserved protein which can protect and restore the function of dopaminergic neurons in the rat model of Parkinson’s disease, suggesting that CDNF might be beneficial for the treatment of Parkinson’s disease. CDNF has unique sequence and structure which suggesting the possible dual modes of action. CDNF can be secreted extracellular and interact with unknown receptors on the cell membranes, and also can be retained in the endoplasmic reticulum (ER) and function as ER stress response protein to regulate ER stress and maintain the ER homeostasis. Our previous studies found that the two key α-Helix in CDNF protein, which α1 mutant cause most CDNF protein reside in the ER and can’t secret out cells, but α7 mutant cause most CDNF protein secret out cells and can’t reside in the ER. On this basis, we propose two problems: ①Whether can mutant of α1 and α7 alter the dual modes of action of CDNF? ②Whether can mutant of α1 and α7 affect the neurotrophic activity of CDNF on dopaminergic neurons? Study on these two scientific issues will help us understanding the dual modes of action of CDNF preliminarily and providing support for exploring the mechanism of CDNF on dopaminergic neurons.

脑多巴胺能神经营养因子（CDNF）对多巴胺能神经元有特异的保护和修复作用，因此在帕金森病的预防和治疗中有着极大的应用前景。因CDNF独特的蛋白结构和功能，有学者提出其双重作用模式学说：既可像经典的神经营养因子一样，分泌出细胞外，通过与未知受体结合发挥其神经保护作用；同时也可作为内质网应激反应蛋白，驻留在内质网内，维持内质网稳态，避免细胞凋亡。我们前期研究发现，CDNF蛋白的二级结构以α-Helix为主，其中α1突变引起大部分CDNF蛋白驻留于内质网，不能分泌出细胞；而α7突变则使大部分CDNF蛋白分泌出细胞，不能驻留于内质网。在此基础上，我们提出两个科学问题：①α1和α7突变是否改变了其双重作用模式？②α1和α7突变是否影响CDNF的多巴胺能神经营养活性？对这两个科学问题的研究，将有助于初步了解CDNF的双重作用模式，并为深入研究CDNF特异性保护多巴胺能神经元的作用机制奠定基础。

脑多巴胺能神经营养因子（CDNF）对多巴胺能神经元有特异的保护和修复作用，因此在帕金森病的预防和治疗中有着极大的应用前景。研究表明，CDNF具有双重作用模式，可分泌出细胞外也可驻留于内质网。我们前期研究发现，CDNF蛋白的二级结构中的两个关键结构域，α1和α7，可调控CDNF的胞内运输和分泌，但二者是否改变了其双重作用模式以及对CDNF的多巴胺能神经营养活性的影响仍是未知。. 本项目主要完成了以下工作：. 1.构建了NanoLuc融合质粒，通过荧光素酶活性分析，对α1和α7的突变引起的CDNF的分泌水平改变进行了定量分析，从而明确α1和α7的突变改变了CDNF的双重作用模式，即α1突变引起CDNF蛋白大部分驻留于内质网，α7突变则使大部分CDNF蛋白分泌出细胞，从而为探索CDNF的神经营养活性奠定基础。. 2.在PC12细胞中利用6-OHDA建立PD模型，证实α1和α7突变体可促进TH的表达，抑制α-Synuclein的表达，同时可通过调控CHOP和GRP78表达缓解内质网应激，还可促进细胞的存活，抑制细胞的凋亡，并可调控PI3K/Akt、Ras/MAPK及NFκB三个PD相关的经典信号通路的活化，从而在细胞水平上证实了α1和α7突变体对CDNF的神经营养活性的影响，其中α7突变体的作用更为明显。. 3.通过脑立体定位注射6-OHDA建立大鼠PD模型，通过脑内注射CDNF及其突变体的重组腺病毒，诱发侧转进行动物行为学实验和TH免疫组化实验，证实α1和α7的突变对CDNF的多巴胺能神经营养活性产生不同的影响，其中α1的突变对其活性无明显影响，而α7的突变则可上调CDNF的神经营养活性。. 本项目对CDNF的双重作用模式进行了研究，并为深入研究CDNF特异性保护多巴胺能神经元的作用机制奠定基础。