多巴胺能神经元中活性氧抑制nAChR活性的分子机理

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer’s disease, and affects 1-2% of people over the age of 60. Although its etiology remains elusive, it is considered that oxidative stress is one of the most important causes in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Previous studies demonstrated that the dopaminergic neuron in the substantia nigra was abnormally vulnerable to reactive oxygen species (ROS) due to its specific circumstances and the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) located on the dopaminergic neuron played a role in modulating dopamine release, however the effect of ROS on the nAChR activity and potential consequence are still not clear. In this project, we plan to first investigate the structure-function relationship of the nAChR, then employ the site-directed mutagenesis, patch clamp recording, amperometry recording with carbon fibre on the brain slice, gene knock-out, and so on, to test our hypothesis: mildly elevated ROS in the dopaminergic neuron may interact directly with the conserved cysteine in the M1-M2 linker of the nAChR, resulting in the receptor subunit covalently cross-linking and restricting the conformational change, and consequently nAChR inactivation; as a result, the dopamine release from the dopaminergic neuron will be inhibited. Shortly, the primary goal of this project is to confirm that the elevated ROS in dopaminergic neuron may inactivate the nAChR, and investigate deeply the molecular mechanism underlying the nAChR inactivation by ROS, and try to explore its potential implication for the dopamine release from the dopaminergic neuron. Delineating these mechanisms holds promise to help deeply understand the PD and aid in the design of novel therapies for the treatment of PD.

帕金森病是仅次于阿兹海默病的第二大神经退行性疾病。尽管病因不清，但氧化应激被认为是发病的重要因素。前人研究表明黑质致密区多巴胺能神经元由于其特殊的处境极易受到活性氧的攻击，而且多巴胺能神经元上的烟碱性乙酰胆碱受体（nAChR）对多巴胺的释放起着重要作用，但是活性氧对nAChR活性的影响及可能的后果还不清楚。本研究通过对nAChR进行结构-功能分析，采用定点突变，膜片钳记录，脑片微碳纤电极安培法记录及基因敲除等方法，验证我们的实验假设：多巴胺能神经元内ROS通过氧化nAChR M1-M2 linker上保守的半胱氨酸而使受体交链起来，从而限制其构象的继续变化，进而导致nAChR失活，最终影响到多巴胺的释放。通过本课题，要明确活性氧可以使多巴胺能神经元上的nAChR失活，阐明nAChR失活背后的分子机理，探索其对多巴胺递质释放的影响，为深入理解帕金森病的发病机制和开发潜在药物靶点提供新思路。

帕金森病是仅次于阿兹海默症的第二大神经退行性疾病。尽管病因不清，但氧化应激被认为是发病的重要因素。前人研究表明多巴胺能神经元上的烟碱性乙酰胆碱受体（nAChR）对多巴胺的释放起着重要作用，但是活性氧对nAChR活性的影响及可能的后果还不清楚。本研究试图验证我们的实验假设：多巴胺能神经元内活性氧（ROS）通过氧化nAChR M1-M2 linker上保守的半胱氨酸而使受体交联起来，从而限制其构象的继续变化，进而导致nAChR失活，最后影响到多巴胺递质的释放。实验上，首先实验发现H2O2可以导致α4β2 nAChR失活，而将α4和β2亚基上位于M1-M2 linker上保守的半胱氨酸突变为丙氨酸后逆转该受体的失活。然后，通过结构模拟，发现相邻亚基α4和β2上两个保守的半胱氨酸残基之间的距离为5.852 Å；这个距离范围内相邻的半胱氨酸极有可能被被氧化从而被交联起来。通过western blotting检测发现在非还原状态下α4和β2亚基交联后形成高分子量组分，而突变体α4 C245A 与β2 C237A可阻止该高分子量组分的形成。进一步地，我们发现由6-OHDA引起神经细胞内ROS水平升高后导致α4β2 nAChR电流降低，抑制了儿茶酚胺的释放。通过这些研究，明确了活性氧对nAChR的失活作用，阐明了nAChR失活背后的分子机理，按计划完成了项目的全部研究内容，为深入理解帕金森病的发病机制提供了新思路。.额外地，基于氧化应激在帕金森病中的重要作用，我们还我们筛选到了针对α-syn的适配体，并且在原代神经元和PD的小鼠模型上验证适配体可以抑制α-syn的聚集和由此产生的氧化应激，并对小鼠的PD行为症状具有缓解作用。通过这些研究，为PD的干预策略研究提供了新思路.总之，本课题组已经完成全部计划的研究内容，并在此基础上，筛选到了针对α-syn蛋白的适配体，并且实验证明适配体可以抑制因α-syn的聚集而产生的氧化应激，从而对PD小鼠的行为症状有缓解作用。成果上，已发表SCI论文6篇，发表5篇中文核心期刊文章，参加国内外学术交流活动共2次，培养硕士生5名。此外，在该项目的资助下，获得北京市自然科学基金面上项目一项。