神经酰胺在急性肺损伤中对肺泡上皮屏障功能调控作用的研究

Acute lung injury (ALI) is a syndromes with high morbidity and mortality in critically ill patients. Pulmonary edema is one of the most important pathophysiological characteristics of ALI . What's more, pulmonary edema is a key factor affecting the prognosis of ALI. Recent studies showed that ceramide played an important role in the development of ALI pulmonary edema. Most studies is limited to the regulation of ceramide on vascular endothelial barrier, and seldom studies focus on ceramide-mediated regulation of alveolar epithelial barrier function. In previous work, we had successfully established exogenous ceramide-induced pulmonary edema mice model, and found the alveolar epithelial barrier was impaired and tight junctions proteins were significantly decreased .Our research group intends to have a further study on regulatory effects of ceramide on alveolar epithelial barrier in the separated primary mouse alveolar epithelial cells and mouse models, and explore whether inhibition of endogenous ceramide generation can effectively improve alveolar epithelial barrier function.

急性肺损伤（ALI）是临床常见的高发病率、高病死率的疾患，目前尚无有效的治疗手段。肺水肿是ALI 最主要的病理生理特征之一，更是影响预后的关键因素。近年来的研究表明，神经酰胺在ALI 肺水肿发展过程中发挥重要作用，而相关机制研究仅局限在神经酰胺调节血管内皮细胞屏障功能上，对于神经酰胺与肺泡上皮屏障功能的研究甚少。我们在前期研究中发现通过气管注入神经酰胺能成功诱导小鼠肺水肿模型，且模型中肺泡上皮屏障功能受损、上皮细胞紧密连接蛋白表达下降。我们推测在ALI肺水肿中神经酰胺可能对肺泡上皮屏障功能发挥调控作用。本课题拟通过分离培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞、建立单层细胞体系，进一步明确神经酰胺对上皮细胞屏障功能的调节作用，并在单层细胞体系和小鼠模型中探讨特异性抑制内源性神经酰胺生成能否有效改善肺泡上皮屏障功能，为ALI治疗提供新的治疗思路。

急性肺损伤的最显著病理学变化是弥漫性肺泡上皮细胞损伤，引起肺泡上皮屏障功能降低，导致ALI/ARDS 的基本病理生理改变—非心源性肺水肿。大量研究表明神经酰胺在ALI 肺水肿发展过程中发挥重要作用，而相关机制研究仅局限在神经酰胺调节血管内皮细胞屏障功能上，对于神经酰胺与肺泡上皮屏障功能的研究甚少。本课题组通过分离、培养小鼠肺泡原代上皮细胞并建立单层细胞层体系，应用外源性神经酰胺刺激明确神经酰胺调节肺泡上皮屏障的作用及相关的分子机制；在小鼠ALI模型中探讨抑制内源性神经酰胺表达能否安全有效改善肺泡上皮屏障功能以及小鼠急性肺损伤肺水肿。在成功构建的小鼠原代Ⅱ型肺泡单层上皮细胞体系中研究发现：①外源性神经酰胺可以提高肺泡上皮屏障通透性，应用免疫蛋白印迹(Western blot)和实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-4蛋白水平和mRNA水平表达的影响，明确神经酰胺通过抑制紧密连接蛋白表达增加上皮细胞通透性；②不同浓度神经酰胺刺激小鼠原代AEC Ⅱ，在不同时间段MTT法检测细胞活性，通过流式细胞术、TUNEL法检测细胞凋亡，结果证明C8-神经酰胺可降低肺泡上皮细胞生存率，并具有明显的诱导细胞凋亡作用；③在小鼠原代AECⅡ构成的单层细胞体系中给予TNF-α 刺激，应用ASMase抑制剂可以抑制神经酰胺生成，改善紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-4蛋白水平和mRNA水平表达，伴随着减轻TNF-α导致的肺泡上皮通透性升高。在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中肺组织酸性鞘磷脂酶（AMase）活性明显增加，通过丙咪嗪可明显抑制AMase活性及神经酰胺生成并抑制急性肺损伤小鼠肺水肿。通过Western blot及免疫组化检测明确在ALI模型中，肺泡上皮细胞间紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin及Claudin-4）表达下降，而丙咪嗪可减轻急性肺损伤小鼠上皮细胞间紧密连接蛋白表达下降。本研究有助于探讨明确神经酰胺对上皮细胞屏障功能的调节作用，进一步明确ALI肺泡上皮通透性升高的分子机制，为ALI治疗提供新的治疗思路。