胰高糖素样肽-1调控人胰岛β细胞定向分化的分子机制研究

It has been demonstrated that glucagon-like peptide-1 (GLP-1) promotes pancreatic β cell neogenesis. However, the mechanism involved is poorly understood. Our previous studies showed that GLP-1 could promote human embryonic stem (hES) cells to differentiate into insulin producing cells. We also confirmed that miR-375 played important regulatory roles during this process. Our preliminary experiments revealed that GLP-1 decreased the expression of miR-375, and that miR-375 downregulated the expression of pancreatic islet-specific transcription factors Pax6 and Hnf1β. Based on the above observations, we speculate that GLP-1 enhances β cell differentiatian and maturation via islet-specific miRNA and transcription factors. In this project, we intend to explore the molecular network of GLP-1 regulating islet β cell differentiation, by investigating the interactions among GLP-1 receptor and its signaling pathways, miRNA involved in islet development and differentiation (such as miR-375), and islet-specific transcription factors (such as Pax6 and Hnf1β). This project will present an novel insights into the roles of GLP-1 agents in regulating human islet β cell conservation, and provide new evidences for the clinical application of GLP-1-based therapies on pancreatic β cell function reconstruction.

业已证实，胰高糖素样肽-1（GLP-1）可促进胰岛β细胞新生，但其分子机制尚不明确。本课题组的前期研究发现，GLP-1可促进人胚胎干（hES）细胞定向分化为胰岛素分泌细胞。此外，我们还证实miR-375在hES细胞定向分化为胰岛素分泌细胞过程中发挥重要的调控作用。本项目预实验结果显示，GLP-1可下调分化细胞中miR-375的表达，而miR-375则可下调胰岛转录因子Pax6和Hnf1β的表达。因此，我们推测GLP-1可能通过调控胰岛特异性miRNA和转录因子从而促进β细胞定向分化。本项目拟探讨GLP-1受体及相关信号通路、胰岛分化发育关键miRNA（如miR-375）、胰岛特异性转录因子（如Pax6和Hnf1β）之间的关系，阐明GLP-1调控人胰岛β细胞分化的分子网络。本项目有助于阐明GLP-1药物改善胰岛β细胞功能的新机制，为该类药物在重建胰岛β细胞功能方面的临床应用提供新的理论依据。

GLP-1可以促进人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）定向分化为胰岛素分泌细胞（insulin producing cells, IPCs），但其具体机制尚不清楚。我们采用定型内胚层途径的改良五步法方案，诱导hESCs定向分化为IPCs，发现该过程中miRNA呈现特异性的变化趋势。本研究进一步探讨GLP-1类似物利拉鲁肽通过miR-375对hESCs分化为IPCs的调控作用，并分析其潜在的作用机制。.在定型内胚层途径诱导分化方案添加GLP-1类似物利拉鲁肽，研究组分化第五阶段细胞（胰岛素分泌细胞）的Nkx6.1和Pax4表达水平明显升高，胰岛素的表达水平同样也可见显著升高，分化细胞的高糖刺激下的胰岛素分泌反应增强。免疫荧光和western blot分析显示，定型内胚层途径诱导分化方案研究组中第四阶段的胰腺内分泌前体细胞和第五阶段的胰岛素分泌细胞均表达GLP-1受体。进一步添加GLP-1受体的阻滞剂和对GLP-1受体进行siRNA敲减，介导作用消失。GLP-1类似物利拉鲁肽后PI3K/Akt磷酸化水平明显升高。进一步添加PI3K/Akt阻断剂后，上述作用被逆转。筛选发现，hESCs分化五个阶段中miR-375表达水平呈先高后低的变化趋势，该变化趋势与人胚胎胰腺发育中的变化趋势相类似。Hnf1β表达水平在分化第三阶段开始明显上升，在分化第四阶段达到高峰，变化趋势与1/miR-375的变化趋势相似。慢病毒感染后，miR-375过表达组的Hnf1β mRNA表达水平与GFP组和空白对照组无显著差异，而miR-375过表达组的Hnf1β蛋白表达水平则下降至GFP组的 (38.75±9.22)%。与GFP组相比，miR-375过表达组分化第四阶段细胞的胰十二指肠同源盒因子1（Pdx1）表达水平显著升高，分化第五阶段细胞（IPCs）的Nkx6.1、配对盒因子4（Pax4）及胰岛素的表达水平则显著降低。因此，GLP-1类似物利拉鲁肽通过GLP-1受体和miR-375对hESCs向IPCs定向分化具有重要的调控作用，该作用可能是通过影响转录因子Hnf1β表达而实现的。.本研究初步阐明GLP-1对信号转导通路、胰岛特异性转录因子及miRNA的作用，有助于明确GLP-1促进hES细胞定向分化的分子机制和GLP-1类药物的新作用。