FOXO1靶向下调STX17阻碍自噬流参与支气管肺发育不良的机制研究

Excessive apoptosis following oxidative stress is thought to be involved in the development of all bronchopulmonary dysplasia (BPD), and its exact mechanism has not been elucidated. In the preliminary work, the applicant firstly confirmed that the autophagic flux was blocked, and the autophagosome could not degrade normally and the high concentration could promote the apoptosis of alveolar type II epithelial (AT-II) in BPD. The decreased expression of Syntaxin-17 (STX17) may be the key link leading to the obstruction of autophagic flux. Further, we found that FOXO1 expressed an abnormal increase in BPD and may interfere with autophagy by directly acting on STX17. Based on this, the project is based on the BPD animal model, the primary oxidative stress AT-II cell model, and establish FOXO1, STX17 high/low expression AT-II cells, and EMSA, Co-IP, Live cell fluorescence imaging , transmission electron microscopy and other methods confirmed the role of FOXO1 in the development of BPD, and clarified the mode of action and target of FOXO1 with STX17 gene, revealing the molecular mechanism of FOXO1 blocking the autophagic flow, and providing new ideas for early intervention to improve BPD outcome.

氧化应激后的细胞过度凋亡被认为参与了支气管肺发育不良（BPD）的发生发展，而其确切的机制一直未能阐明。自噬与氧化应激以及肺发育密切相关，申请者在前期工作率先证实自噬流受阻，自噬内容物不能正常降解能够促发BPD肺泡II型上皮（AT-II）凋亡，而介导自噬体与溶酶体融合的突触融合蛋白17（STX17）表达量减少是导致自噬流受阻的关键环节。我们进一步发现转录因子FOXO1在BPD时表达异常增加，且可能直接作用于STX17干扰自噬。由此，本项目拟在此基础上，应用BPD动物模型、原代AT-II细胞高氧暴露模型，建立FOXO1、STX17高/低表达AT-II细胞，并通过EMSA、Co-IP、活细胞荧光成像及透射电镜等方式，证实FOXO1在BPD肺组织发育中的作用，明确FOXO1与STX17的作用方式及靶点，揭示FOXO1对自噬流阻断作用的分子机制，为早期干预改善BPD结局提供新的思路。

支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia，BPD）是严重威胁婴儿生命和生活质量的疾病，发病率有不断增加的趋势。其远期可能出现肺动脉高压、肺功能异常，甚至认知、教育和行为障碍等并发症。然而目前仍缺乏预防和治疗手段。BPD肺发育不良的机制目前主要包括氧化应激损伤、炎症介质增加、肺祖细胞和干细胞受损或分化异常等。我们前期的研究结果表明 BPD肺组织早期存在自噬过程受损和mTOR异常活化，自噬促进剂雷帕霉素能够改善BPD新生鼠肺发育结局（已发表）。但是，雷帕霉素抑制过高的mTOR的同时，可能影响机体的生长，因此，我们期待能寻找mTOR的下游能够通过影响自噬参与对BPD保护作用的靶点。BPD时存在自噬流受阻，突触融合蛋白17（syntaxin 17，Stx17）是一种可溶性的介导特异性膜识别及融合的受体蛋白（SNARE），它能与另一种SNARE蛋白VAMP8结合，这种结合是自噬体与溶酶体识别和融合所必须的。我们的前期研究首先发现BPD时Stx17表达降低，且雷帕霉素（mTOR抑制剂）可以部分恢复Stx17的表达（成果1），但是具体机制不明。我们研究发现FOXO1可影响BPD时Stx17的转录，从mRNA水平抑制Stx17的表达（成果2，投稿中）。有趣的是，BPD进一步发展后，Stx17在蛋白水平的表达与mRNA不同，并未出现降低。最新研究表明Stx17磷酸化可能影响其自噬功能，通过CoIP发现作为磷酸激酶的mTOR蛋白与Stx17蛋白可以直接结合，且氧化应激下Stx17的蛋白总水平无明显改变，但其磷酸化发生明显增加（成果3，未发表）。由此，我们推测在BPD时Stx17的转录水平及蛋白修饰均存在异常，并在不同时期影响其发挥促进自噬体与溶酶体结合的作用，阻碍自噬流，这可能是BPD时发生自噬缺陷的机制之一。