基于多通道比率型单荧光探针的过氧化亚硝酰和一氧化氮同步检测及成像

Peroxynitrite (ONOO-) and nitric oxide (NO) are the extremely important reactive nitrogen species (RNS) in human body. Although ONOO- and NO play different roles in physiological and pathological processes, at the same time, they have interplaying roles in the complex signal transduction and oxidative pathways. Therefore, the high-sensitivity collaborative detection of RNS is of great guiding significance for exploring the unknown world of life science. However, most of the existing fluorescent probes can only detect one kind of RNS. In this project, based on the fluorescence resonance energy transfer (FRET) system, we first design the donor-acceptor-switchable FRET fluorescent molecules through the combination of theoretical calculation and experiments, and then further develop the single fluorescent probe that can respond to ONOO-/NO with multi-channel ratiometric signals. Through the systematically studying the recognition process and the signal regulation mechanism, a multi-channel fluorescence analysis method for distinguishing ONOO-/NO is established. Furthermore, the multi-channel ratiometric fluorescence imaging is used to obtain the inter-relationship between ONOO- and NO at the subcellular organelles level. The present project will provide a simple and effective analysis method for exploring the synergistic changes and the biology process in the occurrence and development of ONOO-/NO-related diseases at the subcellular organelles level.

过氧化亚硝酰阴离子(ONOO-)和一氧化氮(NO)作为极其重要的活性氮自由基，在生理过程中发挥着不同的功能，同时彼此之间相互协作相互影响，对它们的高灵敏度协同检测对探索生命科学的未知世界具有重要的意义。本项目针对目前大多数荧光探针只能检测一种活性氮的问题，基于荧光共振能量转移系统，通过理论与实验相结合的手段，对能量供体-受体进行合理设计，构建识别前后能量供体-受体可切换的荧光分子，并利用该分子发展能分别和同时识别ONOO-和NO的多通道比率型单荧光探针。通过系统研究探针的识别过程和信号调控机制，建立ONOO-和NO的多通道比率荧光分析方法；并进一步通过多通道比率荧光成像实现ONOO-和NO的分别和同时检测，获取亚细胞器水平ONOO-和NO的协同变化信息。本项目研究为探索ONOO-和NO浓度水平的协同变化以及与之相关的亚细胞器水平生物学过程，提供了简单有效的分析手段，具有重大的科学意义。

活性氮自由基（RNS）在许多生理过程中发挥着重要功能，对它们的精准检测对临床疾病诊断与治疗具有重要意义。本项目以“高性能荧光探针研究”为主线，发展系列性能优异的荧光染料平台，并以此为基础开展活性氮自由基分子探针的设计合成与性能评价，获得了系列高性能的目标活性氮分子探针，并用于细胞与动物模型中相关生物分子的动态检测，及与相关疾病关系的研究。具体研究成果总结如下：. 针对双光子染料在面对强氧化性活性氮物种时，荧光探针的染料骨架容易遭到破坏而造成信号失真问题，申请人构建了系列具有高稳定性的新型氮杂环双光子荧光染料NTP，在此基础上发展了针对强氧化性ONOO-的成像探针，并用于CCl4引起肝损伤模型中ONOO-的双光子组织成像，为探究肝损伤发病过程中活性氮物种的变化提供了有效的分子工具。针对单个近红外染料的荧光产生途径（辐射跃迁）和光声途径（非辐射跃迁）相互竞争，极大阻碍双比率型活性氮自由基探针发展的问题，申请人提出能量平衡策略，通过硫原子取代方法将现有的半花菁染料转化为双比率近红外荧光/光声骨架，从而成功构建双比率型活性氮HNO近红外荧光/光声分子探针，并研究了细胞与活体内NO和H2S之间的相互作用，为探究HNO内源性产生提供了一定的支撑。在项目执行的过程中，申请人对项目的研究内容还进行了一定的衍生和扩展，申请人设计合成了一系列光学性能优异，且各具特点的比率型/增强型荧光探针，包括双比率型硝基还原酶、次氯酸荧光探针、高选择性半胱氨酸和二氧化硫荧光探针，并对其在生物体系和疾病模型中进行了系统研究。. 该项目已取得了一系列研究进展，相关研究成果共发表SCI论文6篇，其中通讯作者SCI论文5篇（Angewandte Chemie 1篇，Journal of Materials Chemistry B 2篇，Langmuir 1篇，New Journal of Chemistry 1篇），其它合作SCI论文1篇，共申请发明专利5项，其中授权专利2项，并且有望在生物检测、医学诊断、环境监测等进行实际应用。.