miRNA-338-5p抑制人骨髓基质干细胞成骨诱导分化致骨不连发生机制

miRNAs是继RNA干扰之后的又一研究热点，目前主要是寻找新的miRNAs及其靶序列与人类疾病关系。我们在前期工作中发现miRNA-338-5p在萎缩性骨不连的发生、人骨髓基质干细胞（hMSC）/成骨定向分化过程中起重要调控作用。本研究将通过实时定量PCR和Western blot、成骨功能基因芯片、生物信息学软件预测、构建荧光素酶报告基因质粒和sh-靶基因表达质粒以及miRNA-BMP2双基因共表达腺病毒载体等方法，研究其抑制BMP2诱导hMSC/成骨分化致骨不连发生的分子生物学机制，包括其对骨形态发生蛋白/Smad促成骨分化信号转导通路的影响、其作用靶基因的预测和验证，最后通过动物体内异位成骨实验验证其对骨形成的抑制作用。本研究从全新角度考察骨折愈合过程，为骨折愈合提供全新的理论；为miRNAs成为骨不连早期诊断标记及治疗药靶的应用研究提供依据。

目的： miRNA参与多种生物过程调控，特别与多种疾病发生有关。萎缩性骨不连是创伤骨科棘手的一类疾病，其发病机制不清，我们推测microRNA可能参与骨不连发生调控。方法：利用基因芯片检测萎缩性骨不连患者骨不连断端瘢痕修复组织和骨折患者骨折正常愈合后内固定钢板周围骨痂组织中miRNA表达谱，实时定量PCR加以验证。构建MG63细胞成骨分化模型，测试MG63细胞成骨分化过程特异miRNA表达谱变化。MG63细胞转染miR-628-3p双链RNA mimics继续诱导成骨分化，再检测MG63细胞的成骨能力的变化。利用生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR及Western Blot来验证miR-628-3p可能作用的靶基因。将miR-628-3p和siRUNX2双链RNA mimics分别转染MG63细胞并诱导其成骨分化，检测RUNX2蛋白的表达及成骨分化的表型。构建miR-628-3p和BMP2的双基因腺病毒载体转染MG63细胞进行体内外成骨研究。结果：萎缩性骨不连断端瘢痕修复组织中有9种miRNA表达上调和下调，其中miR-338-5p、miR-149、miR-221、miR-628-3p和miR-654-5p呈高表达并被数据库收录。实时定量PCR结果进一步证实。MG63细胞培养于成骨诱导液其成骨能力明显增强并呈时间依赖性，miR-338-5p和miR149无变化、miR-221表达先升高再降低，而miR-628-3p和miR-654-5p表达逐渐降低呈时间依赖性。转染miR-628-3p和miR-654-5p的MG63细胞继续成骨诱导，发现miR-628-3pMG63细胞成骨分化能力明显受抑制。生物信息软件预测及双荧光素酶报告基因证实，miR-628-3p可以直接作用于RUNX2的3’-UTR，miR-628-3p可显著抑制MG63细胞内源RUNX2 mRNA和蛋白的表达，miR-628-3p和siRUNX2双链RNA mimics可以抑制成骨诱导液增强RUNX2蛋白表达，两者对MG63细胞成骨分化抑制作用相似。通过构建腺病毒载体，体内外成骨实验证明miR-628-3p对BMP2诱导的MG63成骨分化过程具有明确的抑制作用。结论：miR-628-3p靶向RUNX2抑制成骨细胞的定向分化可能是萎缩性骨不连发生原因之一。