海绵共生古菌、细菌的氮循环生态学功能的分子证据

相对于海绵共生微生物多样性，海绵共生微生物生态学功能以及海绵与其共生微生物的关系远未被揭示。海绵在海洋氮循环中起着重要作用，但是海绵共生微生物在其中的作用有待研究证明。至今还没有系统地对海绵共生微生物的硝化、反硝化、厌氧氨氧化功能进行研究的报道。项目以五种不同种属海绵的总样品、海绵细胞样品、海绵胶质层样品为对象，采用不依赖于分离培养的宏基因组、基因文库、荧光定量PCR、反转录PCR等分子技术，系统地对不同海绵及同一海绵不同部位的硝化、厌氧氨氧化和反硝化古菌与细菌多样性及其相关功能基因amoA、nirS进行研究，揭示相关古菌、细菌种群组成及其amoA、nirS基因的分布、多样性、丰度与转录活性特点，从基因水平为海绵共生古菌、细菌在海绵硝化、厌氧氨氧化和反硝化的氮循环中的作用提供证据。该研究对于揭示海绵共生微生物在海洋生态系统氮循环中的作用与相关机制以及海绵与其共生微生物关系具有重要科学意义。

课题针对10种不同海域、不同种属的海绵，采用不依赖于分离培养的分子技术，系统地对硝化、氨氧化和反硝化古菌与细菌的多样性及功能基因进行了全面系统的研究。首先揭示了Phakellia fusca海绵中共生细菌、古菌的多样性组成、相对丰度，发现Phakellia fusca中变形菌门细菌（例如伽马、阿尔法、德尔塔变形菌等）是优势细菌；处于第2丰富的微生物是古菌（主要是泉古菌），在Phakellia fusca的氨氧化中起主要作用。以amoA、nirS、nirK、nxrA这些氮循环功能基因为标记，对来自印度洋、南海、东海的7种海绵中细菌、古菌的氨氧化、反硝化功能进行了研究，发现全部海绵中都有氨氧化过程存在，但是分别仅有AOB或者AOA发挥作用，或者AOA与AOB同时发挥作用。仅有2种海绵发现了nir功能基因，而且分别是nirS、nirK。以nirK、nosK基因为标记，定性、定量地对6种海绵的反硝化进行了分析比较，证明海绵共生细菌对于N2释放具有重要作用。对Astrosclera willeyana共生细菌、古菌的空间分布及其氨氧化与反硝化功能进行了研究，发现一些细菌、古菌在海绵的皮质层、内层的分布具有特异性，例如Bacteroidetes, Frankineae和 Propionibacterineae 仅在内层发现，而Cyanobacteria, Planctomycetacia和Micrococcineae 仅在皮质层检测到；氨氧化细菌AOB仅在内层发现。采用ureC基因为标记，针对海绵Xestospongia testudinaria中ureC基因的多样性及其表达进行了全面研究，证明海绵共生细菌具有转化利用海水中的尿素的能力。RNA水平上的微生物多样性与氮循环功能基因研究证明隋氏地壳海绵中氨氧化古菌是活跃的。根据检测到的nifH、amoA、narG、napA、nirK、norB、nosZ、ureC、nrfA和gltB基因，在海绵S. vesparium中构建了一个几乎完整的氮循环网络。该研究从基因、转录水平为海绵共生古菌、细菌在海绵硝化、厌氧氨氧化和反硝化等氮循环过程中的作用提供了分子证据。