外泌体在口蹄疫病毒传播中的作用

Exosomes are endosome-derived secreted vesicles, which have been shown to be able of transferring virus or viral RNA between cells. In our initial studies, we found that FMDV RNA exists in exosomes isolated from FMDV-infected cells. The FMDV RNA containing exosomes were capable of transmitting FMDV infection to naive cells and this process is resistant to antibody neutralization (nAbs). We speculate that exosome-mediated transmission of FMDV may contribute to viral spreading in a manner that could avoid immune inhibition. To test this hypothesis, the following investigation will be done in this project. First, we will test whether exosome-mediated transmission of FMDV is a ubiquitous phenomenon in other permissive cells, such as BHK-21 cell, IBRS and so on. Next, we will analysis whether FMDV transferring will be hampered in case of exosomes’ biogenesis or release is disrupted (with inhibitors or gene knockdown methods).Third, FMDV subgenomic replicon cells, that could not produce infective viral particles, will be used to investigate the role of exosome-mediated FMDV RNA transfer under conditions in which the contribution of virions can be excluded. Last, We will test whether naïve cattle could be infected by the exosomes isolated form FMDV infected attle. Our research will provide a new insight to unravel the mechanisms of transmission of FMDV.

外泌体是一类内体起源的膜性囊泡，可介导病毒或病毒RNA在细胞间传递。迄今尚不清楚外泌体在口蹄疫病毒（FMDV）传播过程中是否发挥作用。我们前期研究发现从感染FMDV的PK- 15细胞分泌的外泌体中可检测到病毒RNA，将其孵育敏感细胞后可传播病毒感染，该传播途径不能被中和抗体阻断。我们推测FMDV能以外泌体介导的病毒传播途径逃避宿主抗体的中和作用。本项目拟首先在多种易感细胞上观察外泌体介导的FMDV转移现象，然后分析下调ESCRT相关蛋白表达及抑制外泌体释放对外泌体转运FMDV能力的影响并从中确定出关键节点分子，同时探明该传播途径是否依赖于病毒衣壳结构，最后从动物层面验证感染动物分泌的外泌体对易感动物的再感染能力，以此从多方面阐释外泌体在FMDV传播中的作用。研究结果将揭示一种未知的FMDV传播途径，从全新视角探讨FMDV逃避中和抗体的机制。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染疫病，主要感染牛、猪、羊等偶蹄类动物。持续感染现象是FMD的一个重要特点，其形成机制至今无确切答案。我们推测外泌体可能在其中发挥了作用，据此开展了研究工作。从FMDV感染细胞及持续感染动物分离的外泌体中均可检测到病毒RNA，接种敏感细胞后可分离到FMDV，中和抗体无法阻断这一现象。将分离的 FMDV阳性外泌体接种1日龄乳鼠，可以导致乳鼠死亡，中和抗体不能阻断病毒在乳鼠体内的复制及造成的死亡现象。进一步抑制外泌体的形成与释放可以降低感染细胞分泌的外泌体中FMDV RNA含量，并下调了再次感染细胞的病毒滴度。由于我们从FMDV阳性外泌体中仅能检测到病毒RNA，推测外泌体包裹的病毒感染性物质为病毒RNA, 而不含完整的病毒粒子。进一步通过FISH结合免疫荧光试验证实FMDV RNA与外泌体标志物存在共定位。利用氯仿＋RNA酶处理FMDV阳性外泌体，可以极大的降低外泌体中FMDV RNA拷贝数，并影响再感染能力。在此基础上通过FMDV复制子转移试验证实在完全缺失病毒衣壳成分的情况下，FMDV复制子依然可以进入外泌体，并被外泌体介导感染敏感细胞。综上所述，我们的研究证实存在外泌体介导FMDV传播途径，外泌体包裹的病毒感染性物质仅为病毒RNA，其介导的FMDV转移现象并不依赖于衣壳蛋白成分，研究结果从全新的角度揭示了FMDV持续性感染的发生机制。同时，提示我们在FMDV监测时需要对动物体内外泌体进行检测，这一研究结果一旦在田间获得证实，将会极大的推动我国FMD净化工作的开展。.自噬及外泌体均可起源于内体，已有报道证实二者间存在密切联系，本项目进一步开展了FMDV诱导自噬的工作。我们在猪源细胞上证实病毒能够诱导细胞自噬，下调细胞自噬水平可以显著降低病毒复制能力。进一步研究发现FMDV通过激活EIF2S1-ATF4通路，抑制AKT-MTOR通路，导致自噬现象的发生。在此基础上，揭示FMDV是通过病毒衣壳VP2蛋白与宿主蛋白HSPB1相互作用激活上述通路。上述研究结果为进一步深入探索口蹄疫病毒与自噬及外泌体之间的复杂调控关系提供依据。