节杆菌HW08降解苦马豆素关键酶的特性研究

Locoweed, one of the most hazardous plants, distributes the western grassland of China and produces toxin swainsonine(SW). In one hand, domestic animals often get deaths by poisoning because of foraging locoweeds; in the other hand, locoweeds have great nutritive value which is equivalent to purple medic to be explored.In previous study,we isolated a strain of Arthrobacter sp. HW08 which can grow with SW as sole carbon source. In this project,the activity of intra-cellular or ecto-cellular crude enzymes from HW08 will be determined first.Then the key SW-degrading enzymes will be purified using salting-out,dialysis and chromatography.The characteristics of key SW-degrading enzymes will be investigated further.The genes of SW-degrading enzymes will be determined by protein sequencing. Finally we will determine the metabolites after SW degrading and its metabolic pathway using gas chromatography mass spectrometry and liquid chromatography mass spectrometry. Clarification the mechanism of degrading SW by key enzymes in HW08 will be useful for preventing the poisoning of locoweeds and exploring the locoweeds.

疯草是我国西部草原上危害最为严重的毒草，其毒性成分为苦马豆素(SW)。家畜采食疯草后常引起群发性中毒死亡，但疯草具有与苜蓿相当的营养价值，为了能够充分利用疯草资源，本实验室前期对疯草毒素-SW生物降解菌进行了分离，得到了一株能够以SW为唯一碳源生长的节杆菌HW08。本项目在此基础上，首先对HW08菌的胞内、外粗酶进行活性检测,然后采用盐析、透析、层析等方法分离纯化降解SW的关键酶，并对其特性进行研究，通过蛋白质测序分析寻找降解酶基因；用气质联用、液质联用等方法检测关键酶降解SW后的产物，推导降解途径。本研究将进一步阐明HW08菌关键酶降解苦马豆素的机制，为生物防治动物疯草中毒病以及疯草的合理开发奠定基础。

[背景]疯草是中国西部草原危害最为严重的毒草之一，主要包括豆科棘豆属和黄芪属中含有毒性成分苦马豆素（简写SW）的植物。一方面，家畜采食疯草后可引起群发性中毒死亡，造成严重的经济损失；另一方面，疯草具有与苜蓿相当的营养价值。至今，对疯草的有效防治或解毒尚缺乏有效措施。[研究内容]本项目在前期疯草毒素生物降解菌的分离鉴定及特性研究基础上，分离纯化节杆菌HW08中有效降解SW的降解酶；对降解SW酶的特性进行研究；推测关键酶降解SW的代谢途径。[重要结果]HW08菌中降解SW的酶主要定位在细胞内，属于胞内酶；该酶最适温度30℃、pH 8.0；(NH4)2SO4和BSA对该酶活性有保护作用。对SW诱导前后的HW08菌进行差异蛋白质组学分析得到2044个蛋白，筛选P〈0.05差异在2倍以上的蛋白共129个，其中SW诱导后的HW08菌中有45个蛋白表达量上调。GO分析差异蛋白主要来自于细胞、细胞膜及细胞器；分子功能分析这些蛋白以催化功能为主；以参与代谢生物学过程居多。KEGG分析129个差异蛋白共富集到36条代谢途径，参与嘌呤代谢的最多，其次为参与糖酵解/糖原异生和叶酸碳库代谢。应用qRT-PCR方法从转录水平验证基因调节方式，从中筛选了11个蛋白，结果转录组水平与蛋白质组水平的调节方式一致。又分别对乙醇脱氢酶A1R6C3基因AAur_2040、差向异构酶A1R5X7基因AAur_1890、氨基转移酶A1R7I8基因AAur-2474和乙酰转移酶A0JZ95基因Arth-2986进行克隆表达与纯化，气相色谱法检测降解SW能力，结果乙醇脱氢酶A1R6C3降解率最高（46.3%）；其次是异构酶A1R5X7（26.4%）；转氨酶A1R7I8（20.2%）；乙酰转移酶A0JZ95（10.5%）。推测HW08菌降解SW的代谢途径可能先由乙醇脱氢酶将SW结构式中比较活跃的1，2，8位三个羟基脱掉变成酮基；然后经肽脱甲酰基酶作用水解开环（这个基因未克隆出来，可能发生了碱基改变）；在差向异构酶作用下，发生异构化；进而在氨基转移酶作用下脱掉氨基；最后通过CoA-乙酰基转移酶作用进入三羧酸循环，完成SW的降解。[关键数据]可见乙醇脱氢酶A1R6C3在降解SW过程中起到了关键酶的作用。[科学意义]这些结果为深入研究HW08菌降解SW的机理，开发转基因工程菌，综合利用疯草资源奠定了基础。