苦马豆素致山羊神经细胞凋亡的机制研究

疯草是世界范围内危害草原畜牧业的主要毒草，给畜牧业造成巨大损失。前期研究表明，苦马豆素是其主要毒性成分，并通过抑制机体α-甘露糖苷酶的活性而发挥毒性作用，而有关苦马豆素神经毒性机理尚不清楚。本课题选择山羊中枢神经系统作为靶系统，通过建立苦马豆素损伤山羊中枢神经系统的体内外试验模型，检测苦马豆素对神经细胞凋亡率、DNA损伤、凋亡小体、Ca2+浓度、线粒体膜电位及膜通透性转换变化及细胞凋亡信号通路上的关键基因bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase-3和Caspase-8和溶酶体酸性α-甘露糖苷酶表达。从细胞和分子基因水平明确苦马豆素引起神经细胞凋亡的途径与作用机制，以及调控细胞凋亡信号通路的关键基因与溶酶体酸性α-甘露糖苷酶表达的关系，揭示苦马豆素神经毒性作用分子机制，为疯草中毒病防治提供理论依据。

本项目选择大鼠中枢神经系统为靶系统，通过建立SW损伤大鼠中枢神经系统体内外试验模型，采用RT-PCR、Western-blot等方法，检测体内SW亚急性毒性对大鼠组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12和组织α-甘露糖苷酶基因和蛋白表达的影响，以及体外SW致原代培养的大鼠神经细胞形态学，凋亡率，细胞周期，Ca2+浓度及凋亡相关蛋白表达的影响。研究取得以下重要结果：.1. 建立了SW致大鼠中枢神经损伤体内外试验模型 以甘肃棘豆为SW毒源，用添加甘肃棘豆全草15%（含SW0.03‰）、30%（含SW0.06‰）和45%（含SW0.09‰）饲料饲喂大鼠。含SW0.09‰饲料饲喂至77天，大鼠出现不同程度疯草中毒典型症状，建立了大鼠SW亚急性中毒模型；取新生24 h大鼠大脑皮质为试验用神经细胞来源，培养第5天时神经细胞活力最强，确定了SW攻毒时间；通过寇氏法计算SW对大鼠神经细胞24 h IC50 为0.85mg/mL，确定SW攻毒剂量为0.5、1.0 和2.0 mg/mL，建立了神经细胞体外原代培养模型。.2. SW抑制α-甘露糖苷酶mRMA在组织的表达 SW对大鼠各组织MAN2A1 mRNA表达具有一定抑制作用。MAN2A1在脑组织中除大脑分子层、海马辐射层、海马始层、齿状回分子层不表达外，嗅脑、丘脑、下丘脑、中脑、小脑、延髓、脊髓及大脑其它区域均有分布，表达量与神经细胞和颗粒细胞数量成正相关。.3. SW能引起大鼠大脑皮质神经细胞损伤 不同浓度SW作用体外培养的大鼠大脑皮质神经细胞12h，神经细胞胞体减小，突起缩短，神经细胞密度降低，神经网络形成减少，这可能是疯草中毒引起动物神经症状的主要原因之一。.4. 阐明SW诱导大鼠神经细胞凋亡的途径和机制 随SW剂量增加，神经细胞胞核缩小，呈新月形或染色质浓缩，严重时出现凋亡小体，核碎裂且正常细胞数量明显减少；凋亡细胞显著增加，神经细胞中Ca2+浓度升高，且存在明显剂量-效应关系。SW主要通过激活死亡受体通路和内质网应激介导大鼠神经细胞凋亡，而不经caspase依赖型线粒体通路介导神经细胞凋亡。首次阐明SW通过激活死亡受体信号转导通路和内质网应激介导大鼠神经细胞凋亡，为进一步探讨SW神经毒性作用机理奠定基础。