利福霉素SV至B二碳醚键修饰途径的生物催化机理解析

Rifamycins, a classs of naphthalenic ansamycins, are produced by Amycolatopsis mediterranei and their derivatives such as rifampin, rifabutin, rifapentine and rifaximin, are first-line chemotherapy medicines for tuberculosis and leprosy. The much more potent rifamycin SV, widely used for semisynthesis of clinical medicines, is modified at its phenolic hydroxyl C4 with an ether bond linked two-carbon unit to form a modestly active rifamycin B during biosynthesis. By comparative genomic analysis and molecular genetics varification, we proved that within the rifmaycin biosynthetic cluster (rif), only the rif15AB and rif16 encoded transketolase and P450 were essential for the biotransformation of SV into B. Preliminary experimental analyses indicated that this transformation involved at least two enzymatically catalyzed reactions and some redox proteins encoded other than the rif genes. We propose here to dissect the complete biotransformation process and uncover the underlying mechanisms of this novel reaction by reconstructing the process both in vitro and in vivo.

利福霉素是由地中海拟无枝菌酸菌产生的萘环类安沙抗生素，是治疗结核病和麻风病的一线药物。在利福霉素类化合物中，SV不仅可以用来化学（生物）合成结构类似的其它利福霉素类药物，而且在其C-3和C-4位的化学修饰会显著影响药物活性。利福霉素生物合成过程中，SV的C-4位置经过二碳醚键修饰形成生物学效价较低、产量较高的利福霉素B。这类形成二碳醚键修饰的生化过程是独特的，尚无相关酶催化机理报道。虽然通过比较基因组学分析和分子遗传学方法检验，已鉴定在利福霉素生物合成基因簇（rif）中，仅有由rif15AB编码的转酮酶和由rif16编码的P450为催化该转化过程所必需；进一步实验提示，该过程至少存在两步可检测的酶催化反应，而且可能有其它基因编码的特异电子传递体系蛋白参与。本项目将在鉴定上述反应产物及参与蛋白（基因）的基础上，初步解析这一独特生化反应的酶学催化机理。

由于利福霉素的C-3和C-4位置发生化学修饰会影响药物活性，而在利福霉素生物合成过程中，SV的C-4位置经过二碳醚键修饰形成生物学效价较低、产量较高的利福霉素B。这类形成二碳醚键修饰的生化过程是独特的，尚无相关酶催化机理报道。通过前期的比较基因组学分析以及遗传、生化实验证明了由rif15AB编码的转酮酶和由rif16编码的P450为催化该转化过程所必需。本课题希望能够初步解析这一独特生化反应的酶学催化机理：首先纯化富集了rif16突变株的发酵产物利福霉素X，并进行了质谱鉴定，结果表明了X并不是SV到B转化的中间体，而是Rif15反应的一个支路产物；同时也发现rif15AB编码的转酮酶与经典转酮酶以磷酸醛糖作为受体底物，磷酸酮糖作为供体底物不同，可以以利福霉素S或者SV这样一个次级代谢的中间产物作为受体底物，而同时利用磷酸醛糖或者磷酸酮糖作为供体底物完成催化反应，扩展了人们对转酮酶催化的认知。尽管预测到除Rif15之外可能还有其它蛋白协同参与P450 Rif16蛋白的电子链传递，但因为没有获得有活性的Rif16，故体外重构SV到B的催化过程未能如期完成。