利福霉素生物合成中大环氧化重排反应研究

Rifamycins are first-line anti-tuberculosis drugs used in clinic. After decades of application, rifamycin resistance has become a serious problem in public health worldwide. Recently, it is reported that rifamycin analogs bearing modified ansa chain exhibit significant inhibition to multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis. So, it is a practical way to cope with rifamycin resistance through modifying ansa chain of rifamycins. Fortunately, plentiful ansamycins with modified ansa chain have already been produced in nature, except that their macrocycles need to undergo oxidative rearrangement to make them rifamycin analogs with significant antibacterial activity. Based on our previous work, a multifunctional cytochrome P450 carries out the oxidative rearrangement of macrocycle in the biosynthesis of rifamycins, but the detailed process and mechanism of this enzymatic reaction stay unclear. In this project, we further study the complicated process and novel enzymatic mechanism of oxidative rearrangement in the rifamycin macrocycle, and also apply this cytochrome P450 in the modification of other ansamycins to produce rifamycin analogs with varied ansa chain. The results of this project will not only disclose novel catalytic mechanism of cytochrome P450 for rational design of other P450s, but also supply new rifamycins through combined biosynthesis for the combat with rifamycin resistance.

利福霉素是临床上应用的一线抗结核药物，多年的使用使其耐药问题日益严重。近期发现，安莎链发生修饰的利福霉素类似物能有效抑制多重耐药结核分枝杆菌。因此，改造安莎链是对抗利福霉素耐药问题的可行途径。自然界已经进化产生了许多安莎链发生修饰的化合物；但是，这些化合物需要经过大环氧化重排才能产生具有良好抗菌活性的利福霉素类似物。根据前人和我们的研究结果，一个功能强大的细胞色素P450催化了利福霉素大环的两种不同方式的氧化重排反应；但是，反应过程和酶催化机制还没有阐明。本项目在我们前期工作的基础上，深入研究P450酶催化利福霉素大环氧化重排的复杂反应过程和新颖酶学机制，并将其应用于其他安莎霉素大环的氧化。本项目将揭示新颖的P450酶催化机制，为其他P450酶的理性设计及合成生物学应用提供参考；我们的组合生物合成研究有可能产生安莎链发生修饰的利福霉素类新化合物，为利福霉素耐药问题的解决提供新材料。

利福霉素是由地中海拟无枝菌酸菌产生的大环内酰胺类天然产物，其人工衍生物利福平、利福喷汀和利福布汀是临床使用的抗结核药物。虽然利福霉素具有六十余年的临床应用历史，但是其生物合成机制仍未完全阐明，其中包括利福霉素萘环的形成、碳骨架的氧化重排以及众多功能未知的后修饰基因等问题。本项目以利福霉素大环骨架的氧化重排反应为主要研究内容，尝试对利福霉素生物合成机制进行深入解析。我们首先通过基因敲除、体外生化反应发现在自然界广泛分布的利福霉素单加氧酶（Rox）能够催化多种利福霉素类化合物发生C2-N键断裂，形成大环开环的利福霉素失活产物，同时该反应也是抗肿瘤天然产物saliniketal A生物合成过程中的必需步骤，表明Rox既是一种利福霉素抗性机制，也是一个生物合成关键酶。对利福霉素生物合成基因簇中编码黄素单加氧酶的基因rif-orf17进行基因敲除、体外酶促反应、蛋白点突变以及同位素示踪研究，发现该酶既能催化利福霉素SV的C2-羟化反应形成大环开环产物，也能通过Baeyer-Villiger反应催化利福霉素S的C1-羰基氧化脱除，将利福霉素的萘醌结构转化为苯并-γ-吡喃酮结构。两种氧化反应均导致利福霉素抗菌活性下降，表明Rif-Orf17是另一种利福霉素耐药机制。利用我们前期发现的利福霉素产生菌Micromonospora sp. TP-A0468为研究对象进行体内、体外实验，发现两个脱氢酶基因rifS、rifT共同负责利福霉素萘环形成过程中的脱氢芳香化反应；系统进化分析揭示，脱氢酶RifS/T是决定萘安莎类天然产物萘醌形成方式的关键因素。以上结果均已发表（Front. Microbiol. 2020, 11:971；Org. Lett. 2021, 23, 2342−2346；Chin. J. Chem. 2022, 40, 1553—1558）。通过基因敲除/回补、异源表达/底物转化实验发现P450单加氧酶Rif-Orf5能够催化大环骨架C-11/C-12和C-12/C-29两种方式氧化断裂，涉及多区域、多步骤的氧化重排反应；其酶学机制仍在深入研究当中。本项目的研究结果揭示了利福霉素生物合成的多个谜题，为利福霉素耐药性问题的解决、安莎霉素类新化合物的发现和合成生物学改造奠定了基础。