雷帕霉素生物合成途径特异性调控网络的解析与重塑

Rapamycin is a highly effective macrolide antibiotic with antifungal, immunosuppressive, anti-tumor, anti-aging biological activities, etc. The application prospect is very broad. But the production levels of the industrial rapamycin-producing strains is quite low, greatly restricting its large-scale production. The rapamycin biosynthetic gene cluster has been cloned, and there exist up tofive regulatory genes in the gene cluster. The existence of so many regulatory genes indicates that rapamycin biosynthesis is under complex and strict regulation, which may be one of the key reasons for the low yield of rapamycin. At present, the function of these regulatory genes has been initially identified, but the detailed regulatory mechanisms and their interaction is unclear yet. To this end, this study intends to determine the direct target genes of these five regulators, precisely define their DNA binding sites, and to clarify the interaction between these different regulatory factors, using transcriptional analysis combined with DNA/protein interaction detection technology. Meanwhile, we hope to identify the signalling molecules sensed by the key regulators and finally elucidate the pathway-specific regulatory network for rapamycin biosynthesis. Furthermore, we aim to improve the biosynthesis efficiency of rapamycin through reshaping of the pathway-specific regulation network, by engineering the regulators as well as its DNA binding site. It is expected that the research results will provide important theoretical guidance for rapamycin-producing strain improvement by the metabolic engineering approaches.

雷帕霉素是一种高效的大环内酯类抗生素，具有抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤与抗衰老等重要生物活性，应用前景广阔。但其工业生产菌种发酵单位偏低，制约了该重要抗生素产品的大规模生产。雷帕霉素生物合成基因簇已被克隆，基因簇内部存在5个调控基因，预示其生物合成受到复杂严格调控，这可能是雷帕霉素发酵产量偏低的关键原因之一。目前，这些调控基因的功能已被初步鉴定，但具体调控机制及其互作关系尚不清楚。为此，本研究拟通过转录分析结合DNA/蛋白质互作检测技术，确定调控因子直接作用的靶基因，精确定位其DNA结合位点，并厘清不同调控因子之间的互作关系；同时，鉴定关键调控因子感应的上游信号分子，进而深入解析雷帕霉素生物合成的途径特异性分子调控网络。在此基础上，从调控因子及其DNA结合位点2个层次进行途径特异性调控网络的重塑，提高雷帕霉素的生物合成效率。预期研究成果将为雷帕霉素工业产生菌的代谢工程改造提供重要的理论指导。

雷帕霉素是一种重要的大环内酯类抗生素，具有抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤等生物活性，应用广泛。但其工业生产菌种发酵单位偏低，极大制约该重要抗生素产品的大规模生产。雷帕霉素生物合成基因簇内部含有多达5个调控基因，预示其生物合成受到复杂调控，这可能是其发酵产量偏低的关键因素之一。目前，这些调控基因的功能已被初步鉴定，但具体作用机制及其互作关系尚不清楚。本项目通过基因缺失和过表达实验，发现了基因簇内LAL家族调控蛋白RapH的新功能，证实其不仅参与激活雷帕霉素的生物合成，而且还参与另一种聚酮类化合物---洋橄榄叶素生物合成的正调控。随后，运用转录分析、GusA报告系统与DNA点突变实验等技术手段，鉴定了RapH直接作用的下游靶基因及其可能的DNA结合基序，系统解析了RapH协同调控雷帕霉素与洋橄榄叶素生物合成的分子机制。鉴定了AraC家族调控蛋白RapG直接作用的下游靶基因，并初步揭示了RapG和RapH之间的互作关系，RapG参与激活rapH的转录表达。以上成果为全面解析雷帕霉素合成的途径特异性调控网络奠定了坚实基础。完成了雷帕霉素生物合成的途径特异性网络进行了系统改造，包括负调控基因的缺失（rapY和rapS）和正调控基因（rapG和rapH）的组合过表达，显著提升了雷帕霉素的生物合成能力；获得的工程菌株的发酵水平达到595±29 mg/L，较出发菌株提高了1.5倍。在项目实施过程中，开发了基于细菌群体感应与CRISPRi技术的新型自主动态调控系统。运用该系统，对雷帕链霉菌中与雷帕霉素合成前体供应相关的脂肪酸合成、三羧酸循环以及芳香族氨基酸合成途径上的关键节点进行了单独和组合优化抑制，大幅提升了雷帕霉素的发酵水平。最佳工程菌株的发酵水平达到1.8 g/L以上，较出发菌株提高了将近7倍，这是目前报道的最高水平。该系统有望得到广泛应用，为其他放线菌的高产育种提供了通用的技术平台。另外，我们还在链霉菌中开发了胞嘧啶碱基编辑器，它不依赖同源重组，可以实现功能基因的快速、高效失活，为雷帕链霉菌（遗传操作困难）基因组编辑提供了方便的操作工具。