与疼痛相关的P2X离子通道的分子结构和功能的研究

很多人终生被疼痛折磨。现有镇痛药普遍存在副作用和成瘾性。痛定思痛，人类渴望开发新型镇痛药。P2X受体介导神经信息传递，参与神经病理性疼痛，被认为是开发镇痛药的新靶点。其家族有七个亚型，各有两个跨膜区，是ATP门控的非选择性阳离子通道。但其分子结构不是十分清楚。申请者参与克隆了P2X3和P2X4亚型；绘制了P2X2亚型图谱；证明了P2X2第一个跨膜区域（TM1）为螺旋结构。但P2X两跨膜区是否相互作用？ATP如何调节其通透性等问题不明了。在前期坚实的工作基础上，我们拟结合基因突变（半胱氨酸单位点和双位点突变）与膜片钳电生理技术等手段，更进一步研究P2X的结构特征，合理推测两跨膜区各相邻氨基酸残基的距离、位置和空间构象，从生理特征描述通道由开放、扩张到关闭的形态变化，理解P2X离子通道功能与结构的关系，找出药物作用的潜在位点，为开发无副作用、无成瘾性的镇痛药开辟新的道路。

现有镇痛药普遍存在副作用和成瘾性，开发新型镇痛药已迫在眉睫。P2X 受体介导神经信息传递，参与神经病理性疼痛，被认为是开发镇痛药的新靶点。其家族有7个亚型，各有2个跨膜区，是ATP 门控的非选择性阳离子通道，但P2X 两跨膜区是否相互作用？ATP 如何调节其通透性等问题不清楚。项目负责人曾参与克隆了P2X3 和P2X4 亚型；绘制了P2X2 亚型图谱；证明了P2X2 第一个跨膜区域为螺旋结构。本项目结合基因突变与膜片钳电生理技术等手段，更进一步研究P2X 的结构特征，阐明P2X 离子通道功能与结构的关系。.本项目的主要研究内容及重要结果列举如下：.1、我们通过对rP2X2受体的研究发现35对半胱氨酸双突变体都具有正常的通道功能，但是没有一个突变体可以形成二硫键，表明关闭状态下的rP2X2受体中不存在亚基-亚基间氨基酸相互作用。.2、H33C/S345C经二硫苏糖醇还原后导致电流增加2至3倍，表明H33C和S345C在空间距离上足够近可以形成二硫键。Western blot以及双突变循环分析进一步证明His33和Ser345的相互作用存在于亚基内部。.3、H33C/S345C和V48C/I328C在二硫苏糖醇孵育实验进一步表明H33C和S345C可以形成二硫键，同时也为证明了亚基-亚基间相互作用比亚基内部相互作用在P2X通道开放过程中具有更重要的作用提供了依据。.4、首次对P2X4受体背鳍部参与ATP结合进行了全面的功能研究，发现背鳍部L214直接参与了ATP的结合；对电流特征的研究发现，这个氨基酸同时也参与了通道开放和失敏过程中的构象变化。还证实了背鳍部对受体正常功能的发挥具有重要作用。.5、以P2X4受体作为研究对象，采用丙氨酸、丝氨酸定点突变的方法研究连接区氨基酸残基的侧链结构对离子通道门控作用的影响。实验结果表明，Y195A/S, F200A/S和F330A/S这三个氨基酸残基可能参与了受体离子通道门控作用的调节。表明离子通道胞外区与跨膜区之间的连接区保守的氨基酸残基参与了P2X受体构象转变过程中的信号转导过程与离子通道门控作用。.我们对P2X受体背鳍部、跨膜区氨基酸残基之间及连接区氨基酸残基的侧链对离子通道影响的研究，提供了P2X受体空间结构的新数据，为进一步研究P2X受体分子结构提供了新的思路，也为开发无副作用、无成瘾性的镇痛药开辟新的道路。