tRNA 5' 末端加工酶PRORP1催化机理的研究

转运RNA（tRNA）把活化的氨基酸转移到核糖体内进行蛋白翻译，是基因表达的关键一步。具有生理活性的tRNA对细胞极其重要，而tRNA合成过程的紊乱则与多种疾病的发生密切相关。前体tRNA在成熟过程中必须经过5'端前导序列的剪切，此过程通常由核糖核酸酶RNase P 中的核酶 P RNA部分完成。但在拟南芥叶绿体、线粒体及众多高等真核生物的细胞器中, 前体tRNA 5'端序列的剪切功能完全由蛋白酶PRORP1取代,并不具有RNA 部分。本课题针对拟南芥PRORP1 的结构与生化性质进行研究，在获得其晶体结构后，与其它核酸酶结构进行比较，试图了解PRORP1这一在真核生物中高度保守酶的起源和进化。在阐述PRORP1催化机理的分子机制的同时，对其生理意义作出调查。

所有生物体tRNA首先都是以前体tRNA (Precursor tRNA, 简称pre-tRNA)的形式被RNA聚合酶III转录出来，经一系列加工，成为成熟的，具有生理活性的tRNA分子。Pre-tRNA的剪切由数种tRNA核酸内切酶来完成，其中RNase P则是催化剪切pre-tRNA前导序列的重要酶类。PRORP (ProteinaceousRNase P)家族蛋白是在拟南芥（Arabidopsis）中发现的唯一具有RNase P样活性的蛋白质，并且其构成中不含有核酶组分[1]。PROPR 家族包括PRORP1、PRORP2和PRORP3三个成员。PRORP2和PRORP3主要存在于细胞核中，PRORP1存在于叶绿体和线粒体中[2]。由于PROPR蛋白酶独立加工tRNA 5’端的成熟方式极为独特，研究其催化机理具有较高的理论价值。本课题以解析PRORP1的晶体结构为目标，从分子水平上研究PRORP1，了解其底物识别与化学催化机制，并调查tRNA 5’端的成熟酶的进化起源。在项目研究过程中，我们系统地探究了PRORP1蛋白各结构域的特性及其行使的功能。为获得其晶体结构，我们进行了大量的克隆、表达及结晶工作；并且利用体外活性实验的方法，充分研究并揭示了PRORP1蛋白的各片段对于底物pre-tRNA分子的识别及催化的特性, 发现了该酶对底物的广谱性。此外，我们对PRORP1同家族的蛋白PRORP2和PRORP3的表征及结晶尝试。虽然我们并未率先获得PRORP1 纯蛋白的结构及其与pre-tRNA分子的复合物结构, 我们获得了一些用于结晶的生物大分子（或片段）的晶体，这些前期结果对这些分子今后的结构研究，提供了研究基础。