裂殖酵母线粒体tRNA5'加工酶RNase P的鉴定与功能研究

Mitochondria are organelles that produce energy through aerobic respiration. Mitochondria contain their own genomes that encode rRNA、tRNA and proteins that are involved in electron transport oxidative phosphorylation. Mitochondrial RNA processing is the process that is essential for the production of functional mitochondrial proteins. It appears that many human mitochondrial diseases involve defects in RNA processing. However, only recently have we begun to understand mitochondrial ribonuclease P （mt-RNAse P）.In this project, we investigate the subunit composition of mt-RNase P from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe,the interaction between the protein and RNA subuunits of S. pombe mt-RNase P,the substrate recognition of S. pombe mt-RNase P and the functional conservation of the protein subunit of mt-RNase P among Saccharomyces cerevisiae,S. pombe,Arabidopsis thaliana and humans.Our results should not only advance our understanding of the evolution and substrate recognition of of mt-RNase P, but also provide insigt into mitochondrial RNA processing and mitochondrial disease.

线粒体是细胞内有氧呼吸产生能量的细胞器。线粒体含有DNA，其基因组编码自身的rRNA、tRNA 及与与电子传递和氧化磷酸化相关的部分蛋白。线粒体RNA加工是线粒体产生功能蛋白必不可少的过程。许多人类线粒体疾病与RNA加工的缺陷有关。但我们对参与线粒体tRNA前体3'末端加工的核糖核酸酶P（mt-RNase P）的了解刚开始。本课题鉴定裂殖酵母mt-RNase P的组成成分，研究mt-RNase P中的RNA亚基和蛋白质亚基之间的相互作用、mt-RNase P如何识别底物以及mt-tRNA前体5'末端和3'末端加工顺序。此外，研究芽殖酵母、裂殖酵母、拟南芥及人的mt-RNase P中的蛋白质的功能保守性。这些研究结果不但能加深我们对mt-RNase P的进化和mt-RNase P对底物识别机制的了解，而且能帮助我们认识线粒体RNA整个加工过程及人类线粒体疾病。

线粒体是一种具有双层膜结构的、能独立复制的细胞器。线粒体是细胞通过氧化磷酸化产生ATP的场所。线粒体还参与脂肪酸和核酸的代谢、铁硫簇和血红素的合成 、Ca2+通讯、细胞凋亡、活性氧产生、衰老及天然抗病毒免疫等过程。线粒体基因组编码呼吸链复合体的关键亚基和线粒体蛋白翻译需要的rRNA和tRNA。线粒体基因正常表达对线粒体发挥功能至关重要。线粒体功能异常导致神经退行性疾病（如帕金森氏症和阿尔茨海默病）、糖尿病、高血压、肿瘤等疾病。目前我们对线粒体基因表达机制的了解不很清楚。.本课题主要利用模式生物裂殖酵母，研究与线粒体基因表达至关重要的线粒体tRNA 5末端加工酶RNase P。我们发现裂殖酵母线粒体RNase P与线粒体内膜紧密结合。我们建立了体外裂殖酵母线粒体RNase P酶活测定方法，并对其酶学活性进行了分析。我们对裂殖酵母线粒体RNase P的组分进行了鉴定。我们发现与芽殖酵母线粒体RNase P相似，但与哺乳动物线粒体RNase P不同（完全由蛋白质组成），裂殖酵母线粒体RNase P由细胞核编码的RNA（rnpB RNA）和蛋白质组成。裂殖酵母rnpB RNA与芽殖酵母的RMP1 RNA序列同源。PPR蛋白主要存在真核生物细胞器中，参与细胞器RNA代谢过程如RNA编辑、成熟、稳定性和翻译。已经报道线粒体RNase P含有至少一个PPR蛋白。裂殖酵母中存在10个PPR蛋白（Ppr1-Ppr10），但我们发现这些PPR蛋白都不参与裂殖酵母线粒体tRNA 5末端的加工，不具有裂殖酵母线粒体RNase P的活性。我们深入研究发现缺失ppr3, ppr4,ppr6 and ppr10会引起细胞絮凝、菌丝生长、破坏铁稳态，最终导致细胞凋亡。Ppr10定位于线粒体基质，对细胞有氧呼吸生长是必需的。通过RNA免疫共沉淀实验发现，Ppr10能特异地结合线粒体mRNA并能激活其翻译。免疫亲和纯化和GST-pulldown实验发现Ppr10与Mpa1形成一个复合体。Mpa1也定位于线粒体基质，不但能保护Ppr10避免线粒体基质中的蛋白酶Lon1的降解，而且对Ppr10发挥正常功能至关重要。我们推测Mpa1可能调控Ppr10的功能。我们还发现Ppr10能与线粒体蛋白翻译起始因子2相互作用，在线粒体mRNA翻译起始阶段发挥作用。这些研究对我们认识线粒体基因表达机制具有重要意义。