BDNF和TrkB受体及其DNA甲基化在低氧预适应小鼠中的作用研究

Hypoxic preconditioning is an endogenous protective function of tissue and cells to defense stimulation of hypoxia through stimulating some protective molecules, but the molecular mechanism is still inconclusive. The changes of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and tropomyosin-related kinase B (TrkB) had been observed in the process of ischemia/hypoxia, and it might be one of the endogenous neuroprotective mechanisms of hypoxic preconditioning. However, it still needs further study. DNA methylation is an important way of epigenetic modification. Sequence analysis showed that BDNF and TrkB gene promoter had potential DNA methylation sites. DNA methyltransferase (DNMT) might alter the methylation status of these loci and regulate gene expression. Moreover, whether hypoxia preconditioning may regulate the expression of BDNF and TrkB receptor to play a neuroprotective role through DNA methylation, it has not yet been studied. Therefore, we used the hypoxic preconditioning model of mice and HT22 cells to clarify the changes of BDNF, TrkB receptor and its DNA methylation in hypoxic preconditioning. Then DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza and plasmids were used to down and up-regulate the expression of DNMT, and finally we might reveal the mechanism that hypoxic preconditioning alters BDNF and TrkB receptor expression to play an endogenous neural protective role via the regulation of DNMT. The results may provide theoretical guidance for the clinical treatment of ischemia/hypoxia.

低氧预适应是组织细胞调动保护性分子对低氧刺激产生的内源性保护作用，但其分子机制仍未明确。脑源性神经营养因子(BDNF)与其原肌球蛋白相关激酶B受体(TrkB)在缺血/低氧中发生变化，但其在低氧预适应内源性神经保护中的作用仍需深入研究。DNA甲基化是表观遗传修饰的一种重要方式，序列分析表明BDNF和TrkB基因启动子区有潜在的DNA甲基化位点，DNA甲基转移酶(DNMT)可改变这些位点的甲基化程度并调节基因表达。而低氧预适应是否通过DNA甲基化调控BDNF和TrkB受体表达来发挥神经保护作用，目前尚未有研究涉及。因此本项目利用小鼠和HT22细胞低氧预适应模型，首先明确BDNF和TrkB受体及其DNA甲基化在低氧预适应中的变化情况，再分别抑制和过表达DNMT，最终揭示低氧预适应通过DNMT调控BDNF和TrkB受体表达来发挥内源性神经保护作用的相关机制，从而为缺血/低氧的临床治疗提供理论指导。

低氧预适应（HPC）是组织细胞调动保护性分子对低氧刺激产生的内源性保护作用，在明确HPC分子机制的基础上，是能向临床转化为治疗低氧/缺血疾病的潜在策略。项目前期研究表明HPC可能是通过DNA甲基化下调有损伤作用的“坏基因”，并使保护作用的“好基因”表达上调，从而发挥内源性神经保护机制。此外脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB参与神经功能形成多个过程，特别是BDNF在HPC处理前后表达发生改变，其基因启动子区也有潜在的DNA甲基化位点。然而HPC是否通过DNA甲基化调控BDNF和TrkB受体表达来发挥神经保护作用，目前尚未有研究涉及。因此本项目以小鼠与HT22细胞低氧预适应模型为对象，研究BDNF和TrkB受体表达、DNA甲基转移酶（DNMT）表达和活性、BDNF/TrkB信号通路活性，在HPC处理前后的变化情况；并检测BDNF和TrkB受体基因启动子区域甲基化水平在HPC处理前后的改变；最终通过抑制DNMT，揭示HPC介导DNMT调控BDNF和TrkB受体表达来发挥内源性神经保护作用的相关机制。项目研究结果发现，HPC能够提升HT22细胞和小鼠的低氧耐受能力，证实HPC能够上调小鼠海马中神经内源性保护分子BDNF表达并激活TrkB.FL信号通路。此外，HPC能够下调模型中DNMT3A和DNMT3B的表达，以及整体DNMTs和DNMT3B的活性。小鼠海马BDNF基因启动子区的DNA甲基化水平也在HPC处理后显著降低。而通过5-Aza抑制DNMT表达和活性后，结果显示DNMT的确参与了HPC介导的BDNF基因启动子区甲基化水平下降，以及随之引起的BDNF表达上调和信号通路的激活。最终阐明HPC可能下调DNMT3A和DNMT3B的表达和活性，导致BDNF基因启动子区域的DNA甲基化水平降低，上调BDNF表达并激活其TrkB信号通路后，参与HPC提升低氧耐受能力的内源性神经保护机制。项目研究成果证明DNA甲基化调控下的BDNF及其信号通路是HPC的重要分子机制，并且为HPC向临床防治低氧/缺血疾病手段的成功转化奠定理论基础。